王 亮,張元鵬,張榮武,徐 彪,朱來華,肖西志,羅 欣,常維山

2.山東省檢驗檢疫技術(shù)中心,青島 266002;

3.山東省德州市陵縣畜牧局,德州 253500

沙門氏菌是重要的腸道致病菌,是一個很大的菌屬,其血清型超2 000個,我國已發(fā)現(xiàn)216個[1-2]。腸炎沙門氏菌是其中的一種,?？梢痣u、鴨等禽類感染,更重要的是可引起食物中毒。據(jù)報道,日、美等發(fā)達國家發(fā)生的食物中毒事件中40%～80%是由禽沙門氏菌引起的,其中主要病原菌為腸炎沙門氏菌[3]。我國針對于雞感染腸炎沙門氏菌的報道不多,為了解我國雞群及雞產(chǎn)品是否有腸炎沙門氏菌及其感染的情況,我們進行了雞源性腸炎沙門氏的分離鑒定及全國血清學(xué)調(diào)查,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 病料來源 為2008年以來我校獸醫(yī)門診就診的病、死雛雞的肝臟或心臟。

1.2 細(xì)菌分離、鑒定 取病死雞的心臟、肝臟等臟器直接在DHL培養(yǎng)基上劃線分離,恒溫箱中37℃培養(yǎng)24h。選取中間黑色邊緣半透明的小菌落,再在麥康凱培養(yǎng)基上劃線分離。挑取無色透明的可疑菌落,進行純培養(yǎng)。取分離及純化培養(yǎng)的細(xì)菌,進行涂片、染色、鏡檢。

1.3 生化鑒定 參考以往的文獻做了如下生化試驗[3-4],在三糖鐵培養(yǎng)基上表面上進行劃線與并穿刺培養(yǎng),同時接種葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、枸櫞酸銨鹽、V-P試驗 、吲哚、乳糖 、蔗糖 、硫化氫、尿素等微量發(fā)酵管進行生化試驗。

1.4 血清學(xué)鑒定 按照沙門氏菌診斷血清(60種)說明書(寧波天潤生物藥業(yè)有限公司),將臨床所分離的可疑沙門氏菌的培養(yǎng)物與沙門氏菌屬診斷血清進行凝集試驗,10min內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽性。

1.5 PCR

1.5.1 16s和23s rRNA擴增與測序 用CTAB法[5]提取可疑腸炎沙門氏菌的DNA基因組,根據(jù)已發(fā)表的腸炎沙門氏菌16s和23s rRNA以及其他的文獻[6-7]設(shè)計特異性引物,對分離的可疑腸炎沙門氏菌進行PCR擴增。引用16s rRNA引物[8]P1:TCACGACTTACATCCTAC; P2: CTGCTATATCAGCACAAC。擴增的目的片段的長度為697bp。23s rRNA引物序列為 P1:CGGGGGTAGAGCACTGTT T; P2: GGT TTGGGGTACGAT TTGA。擴增的目的片段的長度為761bp。反應(yīng)體系為:10×PCR Buffer 2.5μ L;25mmol/L MgCl2,2μ L;10mmol/L dNTPs 0.5 μ L;上下游引物各0.5μ L;Taq 酶 0.2μ L;滅菌三蒸水 18.3μ L;模版 0.5μ L。16S rRNA 反應(yīng)條件為:94℃10min,94℃45s,52℃45s,72℃1min,72℃延伸10min,30個循環(huán)。23S rRNA反應(yīng)條件為:94℃10min,94℃45s,57℃45s,72℃1min,30個循環(huán),72℃延伸min。

1.5.2 熱激蛋白60(HSP60)序列的擴增 根據(jù)腸炎沙門氏菌P125109MOPA序列中的HSP60序列,設(shè)計一對引物 P1:CGCGACCGTACTGGCGCAG;P2:AACAGCAGCCACT TTCACGATG。擴增片段為556bp反應(yīng)體系同上。反應(yīng)條件為:94℃10min,94℃30s,60℃30s,72℃30s,72℃延伸7min,30個循環(huán)。

1.6 人工感染試驗 將所分離的腸炎沙門氏菌接種于5mL試管中,37℃震蕩過夜培養(yǎng)。對菌液稀釋至0.5麥?zhǔn)蠞舛?接種于 1d的SPF雛雞5只,每只灌服300μ L,對照組不接種。從死亡的雞只中分離細(xì)菌,進行細(xì)菌學(xué)鑒定。

另接種1d齡商品蛋雛雞(海蘭褐公雛,購自泰安東岳種雞場),分組:將20只雛雞分成4組,1,2,3組分別按照1∶100、1∶1 000、1∶10 000比例稀釋,每只灌服300μ L菌液,第4組灌服300μ L生理鹽水作對照試驗。每1d觀察發(fā)病與死亡情況。

1.7 腸炎沙門氏菌凝集試驗

1.7.1 腸炎沙門氏菌凝集抗原的制備 參照有關(guān)文獻[9-11]將試驗步驟加以改進。①將分離株接種于LB肉湯,置37℃震蕩培養(yǎng)24h。用滅菌的生理鹽水洗滌2次,然后調(diào)節(jié)菌液濃度與3號麥?zhǔn)媳葷峁芟喈?dāng)(大約1×1010/mL)②菌液滅活:按菌液體積的0.6%加入甲醛溶液,置37℃震蕩孵育24h,然后做無菌滅活試驗確定細(xì)菌都被滅活。③抗原染色:將滅活的抗原按3%加入結(jié)晶紫染色液進行染色,充分搖勻,室溫放置48h。置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 凝集試驗 根據(jù)參考文獻[6,9]進行凝集試驗。將攻毒的實驗雞只進行無菌采血。各吸取50μ L,與凝集抗原混合均勻,觀察凝集現(xiàn)象。

1.7.3 交叉試驗 用自制的凝集抗原與雞白痢沙門氏菌的陽性血清進行玻片凝集試驗,采集接種腸炎沙門氏菌的雞血,制備簡易的陽性血清與雞白痢凝集抗原進行玻片凝集試驗。

1.8 血清流行病學(xué)調(diào)查 本實驗室主要從山東、江蘇、安徽、河南、河北以及其他的一些省份,采集各個日齡的商品蛋雞血樣共計603份,分別進行玻片凝集試驗。從當(dāng)?shù)?個農(nóng)貿(mào)市場采集四喜丸子1份,豬場1份,魚1份,鴨翅 1份,鴨爪1份,鴨腸1份樣品中分離細(xì)菌鑒定有無腸炎沙門氏菌污染。

1.9 藥敏試驗 對分離的兩株細(xì)菌,進行藥敏試驗測其MIC值。選取臨床常用的丁胺卡那、頭孢曲松、哌拉西林、阿莫西林和克拉維酸鉀、阿奇霉素、頭孢哌酮、克林沙星、粘桿菌素、土霉素、多西環(huán)素、痢菌凈、磷霉素、新霉素13種藥物,將初始濃度定為8 192μ g/mL。將細(xì)菌接種到3ml～5ml營養(yǎng)肉湯中,于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)8h～10h。用麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞舛?。采用倍比稀釋?測定單藥的MIC[12]。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離鑒定 根據(jù)培養(yǎng)特性和形態(tài)學(xué)特征,自11株份可以病料中,分離出3株可疑腸炎沙門氏菌。即sd1,sd2,sd3。

2.2 生化反應(yīng) 三糖鐵培養(yǎng)基呈紅色,上層段為黃色,產(chǎn)生H2S,使培養(yǎng)基變黑。生化試驗結(jié)果見表1。

由表1可見該菌葡萄糖(+)、麥芽糖(+)、吲哚(-)乳糖(-)蔗糖(-)硫化氫(+)、尿素(-)、山梨醇(+)。枸櫞酸銨鹽(-)甘露醇(-)、V-P試驗(-)。

2.3 3株可疑菌株的血清鑒定結(jié)果 1號菌,O3,19(+);Hg,p(+);Hg(+);Hm(+),抗原式:3,9:g,p,m。2、3號菌相同,結(jié)果為,O3,19(+);O9(+);Hg,p(+);Hg(+);Hm(+),抗原式:3,9,19:g,m,p。1號菌根據(jù)考夫曼·懷特沙門氏菌屬抗原表鑒定為庫卡沙門氏菌,2、3號菌根據(jù)O9陽性判斷其為腸炎沙門氏菌[13]。選擇3號菌進行后續(xù)試驗。將3號菌命名為S.enteritidis SD3。

表1 臨床分離菌與腸炎沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌的生化試驗比較Table1 The comparison of biochemistry test among clinical strains,Salmonella enteritidis and Salmonella pullorum

2.4 PCR擴增 提取分離菌S.enteritidis SD3分離株染色體DNA,用設(shè)計的特異性引物擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8%濃度的瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果如圖1。圖1-A顯示,擴增出的目16s rRNA的片段長度約679bp與設(shè)計長度相同。圖1-B顯示,擴增出的23s rRNA片段長度約761bp與設(shè)計長度相同。圖1-C顯示,擴增出的 HSP60片段與設(shè)計長度558bp相同。

選取分離菌的經(jīng)DNA測序和序列分析,表明該菌16s rRNA序列與雞腸炎沙門氏菌(序列號:AM933172)16s rRNA序列完全相同。23s rRNA序列與雞腸炎沙門氏菌(序列號:EU146953)23s rRNA序列100%相同。HSP60與AM933172序列同源性為100%。與鼠傷寒沙門氏菌同源性分別為99%(序列號:CP001363)。

2.5 攻毒結(jié)果 人工接種4d后,SPF小雞開始發(fā)病,5d死亡2只,6d死亡1只,7d死亡2只(總死亡率:100%)。從死亡的雞只中分離的細(xì)菌,與上述鑒定結(jié)果相同。商品蛋雛雞:三組6d死亡1只;7d死亡1只;第12d第 1、2組各死亡 1只(總死亡率:4/15)。采集11只幸存的攻毒實驗雞血清,7只凝集試驗陽性,陽性率63.6%。

圖1 PCR結(jié)果Fig.1 PCR product

2.6 交叉試驗結(jié)果 對腸炎沙門氏菌與雞白痢沙門氏菌的交叉免疫學(xué)試驗,顯示兩者雖屬于D群沙門氏菌,但是并沒有出現(xiàn)凝集現(xiàn)象,結(jié)果為陰性。

2.7 流行病學(xué)調(diào)查 用自制的凝集抗原與采自攻毒雞只的血清進行玻片凝集試驗,除對照組外,其余均發(fā)生凝集現(xiàn)象。對全國603份血樣進行的檢測,共有9份為陽性,其中2份強陽性。8株可疑沙門氏菌株均不能與腸炎沙門氏菌株陽性血清出現(xiàn)陽性凝集反應(yīng)。

2.8 藥敏試驗結(jié)果 S.enteritidis SD3的MIC值為哌拉西林 64μ g/mL,丁胺卡那為 16μ g/mL,頭孢曲松為8μ g/mL,阿莫西林和克拉維酸鉀是125μ g/mL,阿奇霉素 16μ g/mL,頭孢哌酮 8μ g/mL, 克林沙星 4μ g/mL,粘桿菌素 64μ g/ml,多西環(huán)素 8 192μ g/ml,土霉素 256μ g/mL,磷霉素 512μ g/mL,痢菌凈16μ g/mL,新霉素256μ g/mL 。

3 討 論

3.1 本研究所用病料是從我校獸醫(yī)門診就診的病雞體內(nèi)收集的,分離出到的2株沙門氏菌不能反應(yīng)腸炎沙門氏菌的感染率,僅表明目前國內(nèi)確有腸炎沙門氏菌感染。從我們試驗看,攻毒的雞只死亡率較低。試驗組雞只相對于對照組,采食量雖無明顯變化,但身體瘦小,拉稀糞這與其腸毒素作用有密切相關(guān)[14-18]。但是對SPF雞的致死率較高(死亡率:5/5),SPF雞的發(fā)病性較嚴(yán)重,可能與其飼養(yǎng)環(huán)境較好,與病原微生物不接觸,也可能與腸道微生態(tài)有關(guān)。

3.2 交叉試驗的結(jié)果顯示,本實驗室分離的這兩株菌與雞白痢沙門氏菌未見到明顯交叉凝集的現(xiàn)象,雖然這兩種細(xì)菌同屬于D群,可能存在這種交叉現(xiàn)象,但就本實驗室分離的菌來說,這種現(xiàn)象可以不被考慮。

3.3 在我們目前所做的流行病學(xué)調(diào)查表明,腸炎沙門氏菌流行還不像雞白痢那樣較為普遍,600多份的血清樣品檢出9份陽性,說明腸炎沙門氏菌在雞群中感染仍還不普遍。當(dāng)然,這一調(diào)查主要是準(zhǔn)對與蛋雞群的樣本檢測,至于其他雞群的情況,現(xiàn)在還不了解。

3.4 本實驗室從市場購買的禽類制品中沒有分離到腸炎沙門氏菌,這也證明了禽肉制品被其污染的幾率很低。針對感染率較低的情況,這是可能由于我國在蛋雞飼養(yǎng)過程中,經(jīng)常使用定期使用抗菌藥物,因此規(guī)?；B(yǎng)雞場沙門氏菌感染并不嚴(yán)重(在本研究進行的同時,我們同時進行了雞白痢沙門氏菌血清學(xué)調(diào)查,陽性率低于1%),因此本研究所進行的腸炎沙門氏菌的血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)陽性病例較少。

3.5 同時對這兩株菌進行了藥敏試驗該菌對丁胺卡那、頭孢曲松、哌拉西林均敏感。這就可能是我國目前腸炎沙門氏菌未大面積流行的原因。

我國每年因為腸炎沙門氏菌引起的食物時有發(fā)生,并且常是群發(fā)性的中毒。腸炎沙門氏菌具有垂直傳播的特點,能夠在輸卵管和卵黃里分離到,因此食用未完全加熱至熟的蛋品可以導(dǎo)致人類食物中毒[2]。但是我國較少發(fā)生因食用禽蛋導(dǎo)致的腸炎沙門氏菌食物中毒,這與我國飲食習(xí)慣有關(guān)[18]。

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