董學(xué)興，呂林蘭，黃金田，王愛民，於葉兵，許海濤

(鹽城工學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇省沿海池塘養(yǎng)殖生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇鹽城224051)

堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶 (ACP)是生物體內(nèi)兩種重要的水解酶，直接參與磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移，在體內(nèi)細(xì)胞調(diào)節(jié)過程中起重要作用，并與DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝有關(guān)，對生物體的生長具有重要意義;谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (GPT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)則廣泛存在于動物細(xì)胞線粒體中，是重要的氨基酸轉(zhuǎn)氨酶，在機(jī)體蛋白質(zhì)代謝中具有重要作用，其活性變化也是反映肝細(xì)胞生理狀態(tài)的主要敏感指標(biāo)。已有的研究表明，重金屬能通過代謝抑制影響水生生物的生命活動［1-3］。

銅和鎘是環(huán)境中普遍存在的兩種重金屬污染物。銅是動物體必需的微量元素，是蝦類血液中氧載體——血藍(lán)蛋白的中心原子［4］，缺少銅會對其生長發(fā)育產(chǎn)生明顯的影響，但當(dāng)銅離子濃度超過機(jī)體調(diào)節(jié)范圍且在體內(nèi)積累過多時，則會引起中毒［5］;而鎘為生物非必需元素，具有殘留時間長、能蓄積、可沿食物鏈轉(zhuǎn)移蓄積、隱藏性和不可逆性等特點(diǎn)，對人體和水生動物均具有較強(qiáng)的毒害作用［6］。急性毒性實(shí)驗(yàn)表明，克氏原螯蝦Procambarus clarkii具有較強(qiáng)耐受Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)污染的能力［7-8］，但亞致死濃度的Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)對其代謝酶的影響目前尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)中，作者研究了不同亞致死劑量的Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)對克氏原螯蝦肌肉中AKP和ACP活性以及肝胰腺中AKP、ACP、GOT和GPT活性的影響，以探討Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)對克氏原螯蝦代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用克氏原螯蝦購于鹽城郊區(qū)龍蝦養(yǎng)殖場，體質(zhì)量為 (11.35±1.52)g。

主要藥品有:氯化鎘 (CdCl2·2.5H2O，分析純)，由上海金山亭新化工試劑廠生產(chǎn);硫酸銅(CuSO4·5H2O，分析純)，由上海中試化工總公司揚(yáng)州滬寶化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及管理 試驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)8 d，暫養(yǎng)期間連續(xù)充氣，每天定時喂食1次，換水量為1/3，養(yǎng)殖用水為曝氣24 h的自來水。暫養(yǎng)結(jié)束后挑選附肢齊全、健康的個體作為試驗(yàn)蝦。

參考已有研究報(bào)道的安全濃度［7-8］確定本試驗(yàn)中溶液的濃度，按照等對數(shù)間距設(shè)置濃度梯度，Cu(Ⅱ)的濃度設(shè)為 0.055、0.28、1.38、6.88、34.38 mg/L，Cd(Ⅱ)的濃度設(shè)為 0.0048、0.024、0.120、0.60、3.00 mg/L，同時設(shè)1 個對照組，每組設(shè)3個平行。每個水族箱 (100 cm×60 cm×80 cm)中加入試驗(yàn)溶液10 L，放入8只蝦。試驗(yàn)期間不投喂，連續(xù)充氣，每24 h換液一次，水溫為(19±1)℃，沒有蝦死亡。試驗(yàn)時間為96 h，取肌肉、肝胰腺置于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 指標(biāo)的測定 堿性磷酸酶 (AKP)、酸性磷酸酶 (ACP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、蛋白含量均采用南京建成試劑盒測定，具體測定方法參照說明書進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2003初步整理后，用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，如差異顯著，采用LSD法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果

2.1 Cd(Ⅱ)對克氏原螯蝦代謝酶的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，克氏原螯蝦的ACP、AKP活性存在組織差異，肝胰腺酶活性高于肌肉?？耸显r暴露于不同濃度的Cd(Ⅱ)溶液后，其肝胰腺中ACP、AKP、GOT、GPT活性和肌肉中 ACP、AKP活性的變化趨勢基本相同，均隨Cd(Ⅱ)濃度的升高呈先升高后降低的趨勢 (圖1)。

從圖 1可見:肝胰腺中 ACP、AKP、GOT、GPT活性均在Cd(Ⅱ)濃度為0.12 mg/L時達(dá)到最大，分別比對照組顯著升高了58.83%、86.17%、85.66%、70.98%(P＜0.05);在 Cd(Ⅱ)濃度為3 mg/L時，ACP活性較對照組降低了 48.59%(P＜0.05)，而 AKP、GOT、GPT 活性則與對照組無顯著差異 (P＞0.05)。

從圖1可見:肌肉中ACP、AKP活性分別在Cd(Ⅱ)濃度為 0.60 mg/L、0.12 mg/L 時最高;ACP活性除最低濃度組 (0.0048 mg/L)外，在濃度為0.024、0.12、0.6、3 mg/L 時分別較對照組顯著升高了 162.79%、207.36%、224.42% 和94.57%(P＜0.05)。

2.2 Cu(Ⅱ)對克氏原螯蝦代謝酶的影響

同Cd(Ⅱ)對克氏原螯蝦代謝酶的影響類似，克氏原螯蝦肝胰腺中ACP、AKP、GOT、GPT活性和肌肉中AKP活性均隨Cu(Ⅱ)濃度的增大呈先升高后降低的趨勢 (圖2)。

圖1 Cd(Ⅱ)對克氏原螯蝦酸性磷酸酶 (ACP)、堿性磷酸酶 (AKP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (GPT)的影響Fig.1 Effect of Cd(Ⅱ)on activifies of acid phosphatase，alkaline phosphatase，glutamic－oxalacetic transaminase and glutamic－pyruvic transaminase in red swamp crayfish Procambarus clarkii

從圖2可見:肝胰腺中 ACP、AKP活性在Cu(Ⅱ)濃度為0.28 mg/L時均達(dá)最大，分別比對照組顯著提高了 112.53% 和 94.98%(P＜0.05);GOT、GPT活性在Cu(Ⅱ)濃度為6.88 mg/L時達(dá)到最大，其中GOT較對照組顯著提高了120.22%(P＜0.05)。

圖2 Cu(Ⅱ)對克氏原螯蝦酸性磷酸酶 (ACP)、堿性磷酸酶 (AKP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (GPT)的影響Fig.2 Effect of Cu(Ⅱ)on activifies acid phosphatase，alkaline phosphatase，glutamic － oxalacetic transaminase and glutamic－pyruvic transaminase in red swamp crayfish Procambarus clarkii

肌肉中ACP活性隨Cu(Ⅱ)濃度的增大呈上升趨勢，在濃度為0.055、0.28、1.38、6.88、34.38 mg/L時分別比對照組顯著升高了 161.63%、147.29%、242.25%、182.17% 和 214.34% (P＜0.05);AKP 活性在 Cu(Ⅱ)濃度為 1.38 mg/L 時達(dá)最大，較對照組顯著升高了 171.97% (P＜0.05)。

3 討論

代謝抑制是重金屬對水生生物的致毒機(jī)制之一。竇亞卿等［9］的研究表明，Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)能明顯抑制日本新糠蝦Neomysis japonica體內(nèi)ACP和AKP的活力。高濃度鎘離子使羅非魚Tilapia nilotica肝臟、心臟和鰓中的乳酸脫氫酶 (LDH)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性顯著下降，暴露于低濃度鎘中，羅非魚LDH在后期顯著升高［3］。楊志彪等［10］研究發(fā)現(xiàn)，低濃度銅離子對中華絨螯蟹 Eriocheir sinensis肝胰腺和血淋巴中ACP活性具有誘導(dǎo)作用，而高濃度銅離子 (5 mg/L)具有抑制作用。與其相似，本研究結(jié)果表明，當(dāng)Cu(Ⅱ)濃度為0.28 mg/L、Cd(Ⅱ)濃度為0.12 mg/L時，克氏原螯蝦肝胰腺中ACP、AKP的活性最高，此濃度與這兩種離子對克氏原螯蝦的安全濃度較為接近［8］，說明低濃度Cu(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)對克氏原螯蝦ACP、AKP活性有誘導(dǎo)作用。盡管Cu(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)對ACP、AKP活性均表現(xiàn)出誘導(dǎo)效應(yīng)，但其作用機(jī)制可能不同。銅是機(jī)體的必需微量元素，不僅是蝦類血氧蛋白的中心原子，還是細(xì)胞色素氧化酶、酪氨酸酶、過氧物歧化酶等許多酶類的重要組成部分。楊志彪等［10］認(rèn)為，低濃度銅離子對中華絨螯蟹AKP的誘導(dǎo)作用可能是由于銅離子取代了AKP酶活性中心的鋅離子，從而激活其活性，而當(dāng)銅離子濃度增加時，鋅離子已被完全置換出來，多余銅離子就會結(jié)合到酶的去活性位置上，以致酶的活力受到抑制。Cd是機(jī)體的非必需元素，水體中低劑量的鎘離子通過鰓進(jìn)入體內(nèi)后，動物機(jī)體可產(chǎn)生大量熱休克蛋白、金屬硫蛋白(MT)等大分子應(yīng)激蛋白，由于能量供應(yīng)和應(yīng)激分子的合成加強(qiáng)，通常表現(xiàn)為興奮效應(yīng)。暴露于高濃度鎘離子中時，動物體內(nèi)的氧化分解供應(yīng)能力降低，表現(xiàn)為抑制效應(yīng)。Cattani等［11］研究了鎘對舌齒鱸Dicentrarchus labrax代謝的影響，舌齒鱸在濃度為0.5 mg/L和5.0 mg/L Cd(Ⅱ)中暴露4 h后，肝糖原迅速分解，肌肉中游離葡萄糖濃度迅速升高，同時在肝臟中大量誘導(dǎo)合成MT。本試驗(yàn)中設(shè)置的最高 Cu(Ⅱ)濃度為34.8 mg/L，除肌肉中ACP活性顯著升高外，其他代謝酶的活性均處于與對照組無顯著差異的水平，說明克氏原螯蝦對Cu(Ⅱ)有較強(qiáng)的耐受能力［7］。當(dāng) Cd(Ⅱ)濃度為3.0 mg/L時，克氏原螯蝦肝胰腺中ACP活性受到顯著抑制，而十倍于Cd(Ⅱ)的Cu(Ⅱ)濃度未明顯抑制其代謝酶活性，也說明Cd(Ⅱ)較Cu(Ⅱ)對克氏原螯蝦有更大的毒性。

代謝酶活性存在組織特異性。肝胰腺作為解毒器官和脂肪代謝場所，其水解酶類AKP、ACP含量較為豐富。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，肝胰腺中ACP、AKP活性皆高于肌肉的。重金屬對不同代謝酶的影響亦不同。李少菁等［12］研究發(fā)現(xiàn)，日本對蝦Peneaus japonicus暴露于Zn(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)中后，其AKP、GPT、GOT活性受到抑制，且抑制作用隨離子濃度的增大而增強(qiáng)，這3種離子對ACP活性具有誘導(dǎo)作用，而且ACP活性隨離子濃度的增大而增強(qiáng)。本試驗(yàn)中，克氏原螯蝦肌肉中ACP、AKP活性和肝胰腺中AKP、ACP、GOP、GPT活性均隨Cd離子濃度的增大而先升后降，而肌肉中ACP活性除Cd離子濃度為0.0048 mg/L外，其余各濃度均表現(xiàn)出顯著的誘導(dǎo)效應(yīng)。

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