鄭將臣，萬全，程起群，趙金良

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋與河口漁業(yè)資源及生態(tài)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海200090;2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥230036;3.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)種質(zhì)資源與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海201306)

全世界現(xiàn)有龜鱉類動(dòng)物約14科、324種［1］。目前，國外關(guān)于龜鱉目分子系統(tǒng)學(xué)的研究較多［2－10］，國內(nèi)對(duì)這方面的研究相對(duì)較少，且大多數(shù)是基于龜鱉類線粒體的研究［11－15］，而用核基因來分析龜鱉類系統(tǒng)進(jìn)化的研究鮮見報(bào)道。RAG2是重組激活基因 (Recombination activatinggenes，RAGs)的一種。RAGs在脊椎動(dòng)物中普遍存在，在進(jìn)化過程中非常保守，不同物種之間其堿基組成變化很少，近年來被較多地運(yùn)用于物種進(jìn)化和親緣關(guān)系的分析［16－20］。RNA 指紋蛋白 35(RNA fingerprint protein 35，R35)也是一種核內(nèi)基因，目前關(guān)于這個(gè)蛋白的功能尚不明確，但是RNA指紋蛋白35基因被認(rèn)為是單拷貝基因［21］，因此，國外已有若干學(xué)者運(yùn)用RNA指紋蛋白35基因作為標(biāo)記來研究龜鱉類動(dòng)物的系統(tǒng)進(jìn)化［7，22］。

本研究中，作者測定了兩種龜?shù)腞35內(nèi)含子序列和6種龜?shù)腞AG2部分序列，并結(jié)合NCBI上其它龜鱉類的相關(guān)序列，以此來初步探討龜鱉類的系統(tǒng)進(jìn)化特征。

1 材料與方法

1.1 材料

在安徽省長江水生動(dòng)物保護(hù)中心采集6種龜?shù)臉悠?，每種龜各取1只個(gè)體的肌肉組織保存于冰箱(－20℃)中備用。龜鱉類分類地位均依據(jù)國際龜類動(dòng)物分類工作組2009年修訂的最新分類系統(tǒng)［1］。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增和測序 基因組DNA采用標(biāo)準(zhǔn)的酚/氯仿法提?。?3］，略作修改。R35基因擴(kuò)增采用引物R35EX1和R35EX2［22］，序列分別為

RAG2基因擴(kuò)增采用引物 F2(RAG2)和 R2－1(RAG2)［24］，序列分別為

PCR反應(yīng)在50 μL體系中進(jìn)行，包括10×PCR Buffer(Mg2+Plus)5 μL，dNTP Mixture(各 2.5 mmol/L)2 μL，引物 (10 μmol/L)各 2 μL，Taq酶2.5 U，模板DNA 40 ng。反應(yīng)條件為:94℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性45 s，退火 (R35和RAG2分別為58℃和51℃)45 s，72℃下延伸60 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán);最后于72℃下再延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠純化后在ABI3730型DNA測序儀上雙向測序。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 對(duì)所測得的序列進(jìn)行拼接，再用 Clustal X 1.83［25］、DnaSP［26］、MEGA 4.1［27］等軟件對(duì)所有序列進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算其多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、簡約信息位點(diǎn)數(shù)、堿基組成和轉(zhuǎn)換/顛換比率等遺傳信息指數(shù)，并基于Kimura雙參數(shù)模型 (Kimura－2－parameter，K－2－P)［28］計(jì)算種、屬、科間的遺傳距離。為了進(jìn)一步全面研究龜鱉類的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，從NCBI下載龜鱉類的R35和RAG2序列 (表1)一并分析。

分別對(duì)R35和RAG2序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，再將二者合并進(jìn)行分析。采用PAUP4.0bl0軟件中的PHT(partition homogeneity test)方法對(duì)R35和RAG2序列的數(shù)據(jù)進(jìn)行同質(zhì)性檢驗(yàn)［29］。

為了判斷這些序列是否適合系統(tǒng)進(jìn)化分析，用兩種方法對(duì)序列的飽和度進(jìn)行檢測。一種是基于轉(zhuǎn)換和顛換與K－2－P的作圖分析［28］;另一種是運(yùn)用指數(shù) Iss檢測［30］。兩種檢測均在 DAMBE 軟件［31］上進(jìn)行。

采用鄰接法 (Neighbor－joining，NJ)、最大簡約法 (Maximum－parsimony，MP)和最大似然法(Maximum likelihood，ML)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。NJ樹用MEGA軟件構(gòu)建，遺傳距離模型選擇Kimura雙參數(shù)模型，將序列中的轉(zhuǎn)換和顛換位點(diǎn)均視為信息位點(diǎn)并對(duì)所有位點(diǎn)一致性加權(quán)，對(duì)于序列中的插入/缺失位點(diǎn)則采用成對(duì)刪除。MP樹在PAUP4.0bl0軟件［32］上進(jìn)行，選擇簡約標(biāo)準(zhǔn) (Parsimony criterion)、啟發(fā)式搜尋 (Heuristic search)、樹二分再連接 (Tree bisection reconnection，TBR)、逐步加入法隨機(jī)加入序列 (10000 random stepwise addition sequence replicates)，所有數(shù)據(jù)均未加權(quán)。當(dāng)幾個(gè)相同的簡約樹出現(xiàn)時(shí)，最后結(jié)果將由嚴(yán)格一致樹來表示。在ML樹構(gòu)建之前，采用Modeltest軟件［33］確定序列最適合的進(jìn)化模式，ML樹也用PAUP4.0bl0軟件構(gòu)建，參數(shù)與MP法相同。采用Bootstrap檢驗(yàn)分子系統(tǒng)樹各節(jié)點(diǎn)的置信值 (其中NJ和MP樹重復(fù)1000次，ML樹重復(fù)100次)。NJ樹、MP樹和ML樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的一致性用Templeton檢驗(yàn)［34］評(píng)估。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增及序列分析

本研究中成功擴(kuò)增并測序了兩種龜?shù)腞35內(nèi)含子部分序列 (長度為1080 bp)以及6種龜?shù)腞AG2基因部分序列 (長682 bp)，所有序列均已提交GenBank數(shù)據(jù)庫 (登錄號(hào)見表1，用*示出)。其中，RAG2基因682 bp的核苷酸序列共編碼227個(gè)氨基酸，其中有59個(gè)發(fā)生變異。

將從NCBI上下載的其他龜鱉類R35序列和RAG2序列一并分析 (表1)，經(jīng)比對(duì)后，R35的一致序列為941 bp，RAG2一致序列為620 bp，二者合并后得到1561 bp的一致序列，其中共有505個(gè)可變核苷酸位點(diǎn)，總變異率為32.35%;簡約信息位點(diǎn)有239個(gè)，單變異多態(tài)位點(diǎn)有 266個(gè)，插入/缺失為139個(gè)。堿基A、T、G、C的平均含量分別為29.5%、28.5%、22.8%、19.2%。A+T含量為58%，高于G+C含量42%。在505個(gè)核苷酸位點(diǎn)中，轉(zhuǎn)換數(shù)為54，顛換數(shù)為33，轉(zhuǎn)換/顛換比率 (R)為1.64。龜鱉目9個(gè)科間的K－2－P遺傳距離見表2，其中海龜科和鱷龜科之間的遺傳距離最小，為0.025;鱉科和南美側(cè)頸龜科之間的遺傳距離最大，為0.182。PHT檢驗(yàn)顯示，P=0.02＞0.01，因此R35和RAG2序列可以合并。Modeltest檢測結(jié)果顯示，TVM+G為最佳模型，該模型的相關(guān)參數(shù)為:－ln L=6274.6504，K=8，AIC=12565.3008，伽馬分布的形狀參數(shù) (Gamma distribution shape parameter)=1.2752。

基于轉(zhuǎn)換和顛換與遺傳距離的線性關(guān)系分析堿基替代飽和的結(jié)果，顯示堿基轉(zhuǎn)換和顛換在K－2－P遺傳距離小于0.195的范圍內(nèi)均未達(dá)到替代飽和(圖1)。Iss的指數(shù)檢測結(jié)果顯示，在兩尾t檢驗(yàn)下，P=0.0000，Iss值為0.1328，極端對(duì)稱樹臨界值Iss.c為0.7620，極端非對(duì)稱樹臨界值 Iss.c為0.5599，則Iss＜Iss.c，表明堿基替代未飽和。兩種檢驗(yàn)方法都顯示這些序列堿基轉(zhuǎn)換和顛換均未達(dá)到替代飽和，因此可用于構(gòu)建進(jìn)化樹。

2.2 系統(tǒng)發(fā)生分析

Templeton檢驗(yàn)顯示，基于R35/RAG2序列的NJ樹、MP樹和ML樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致 (圖2)。分子系統(tǒng)樹顯示，根據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)劃分的各科成員均以較高的支持率聚在一起，說明基于R35/RAG2序列的系統(tǒng)樹能將各科清晰明確的區(qū)分開。其中潮龜科和陸龜科匯聚成一支后，再與龜科構(gòu)成姐妹群(支持率大于95%)。棱皮龜科與海龜科聚在一起，爾后再與鱷龜科匯聚成一支，說明這三個(gè)科之間可能有較近的親緣關(guān)系。鱉科則位于樹的基部，推測鱉科可能是曲頸龜亞目中分化較早的科之一。

表1 24種龜及其R35和Rag2序列登陸號(hào)Tab.1 The R35＆Rag2 accession numbers of 24 turtle species

表2 龜鱉目9個(gè)科間的Kimura－2－paramete遺傳距離Tab.2 Kimura－2－parameter distances among 9 families in Testudinata

圖1 基于轉(zhuǎn)換和顛換對(duì)Kimura雙參數(shù)遺傳距離作圖檢測R35/RAG2序列飽和程度Fig.1 Saturation test of R35/RAG2 by transitional and transversional variation against K－2－P distances between pairs of taxa

圖2 基于龜鱉類R35/RAG2合并序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the combined R35/RAG2 date sets of turtles and tortoises

3 討論

3.1 龜鱉類系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的分析

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外有部分學(xué)者運(yùn)用線粒體或核基因來研究龜鱉目的系統(tǒng)進(jìn)化，解決了許多龜鱉類傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)上有爭議的問題。然而，有關(guān)龜鱉類科水平或更高分類階元的系統(tǒng)關(guān)系問題還有一些不確定之處，如平胸龜科、海龜類(棱皮龜科和海龜科)、鱷龜科的進(jìn)化位置及其親緣關(guān)系等［10］。

筆者構(gòu)建的系統(tǒng)樹結(jié)果顯示，潮龜科與陸龜科匯聚后，再與龜科聚成姐妹群，且具有較高的支持率。從遺傳距離上看，潮龜科與陸龜科的遺傳距離(0.026)小于龜科和陸龜科的遺傳距離 (0.035)，顯示潮龜科與陸龜科之間的親緣關(guān)系較近，而潮龜科與龜科的親緣關(guān)系比與陸龜科要遠(yuǎn)。因此，本研究結(jié)果印證了陸龜科與潮龜科關(guān)系較近的觀點(diǎn)［7，12，35－36］，同時(shí)也再次驗(yàn)證 Gaffney 等［35］將 Mc-Dowell［36］定義的龜科中的潮龜亞科和龜亞科提升為潮龜科和龜科的科學(xué)性［36］。這也與萬全等［15］基于12SrRNA的研究結(jié)果一致。

本研究中構(gòu)建的系統(tǒng)樹結(jié)果還顯示，陸龜總科，包括潮龜科、陸龜科和龜科與鱷龜科+海龜總科 (包括海龜科和棱皮龜科)構(gòu)成姐妹群，有較高的支持率(MP=100，ML=92，NJ=100)，其中鱷龜科和海龜總科又是處于姐妹群的位置，其支持率均大于65(MP=68，ML=85，NJ=71)。這些與Krenz等［37］運(yùn)用 RAG－1、Cytb、12S rRNA 序列重建的系統(tǒng)樹的結(jié)果一致，與Barley等［10］用14個(gè)核基因序列重建的系統(tǒng)樹結(jié)果也是一致的，但與Parham等［38］基于線粒體全基因組重建的系統(tǒng)樹結(jié)果有差異。線粒體基因和核基因的進(jìn)化速率不同可能是造成這種差異的重要原因。

3.2 核基因標(biāo)記在分子系統(tǒng)學(xué)上的適用性探討

傳統(tǒng)的系統(tǒng)進(jìn)化分析多采用形態(tài)學(xué)和線粒體的數(shù)據(jù)來分析，然而，僅局限于這些數(shù)據(jù)的分析往往會(huì)產(chǎn)生一些誤差，甚至是錯(cuò)誤的結(jié)論。因此，結(jié)合核內(nèi)更多的分子數(shù)據(jù)來分析系統(tǒng)進(jìn)化成為一種必然。本研究中，作者采用兩個(gè)核基因標(biāo)記，其中關(guān)于重組激活基因 (RAGs)的研究比較成熟，RAGs較為保守，因此被廣泛用于動(dòng)物系統(tǒng)進(jìn)化及親緣關(guān)系分析［16－20］;采用的另外一個(gè)分子標(biāo)記是RNA指紋蛋白35(R35)，該蛋白屬于多樣性的7次跨膜蛋白超級(jí)家族的成員，R35的編碼框編碼一段是由723個(gè)氨基酸殘基組成的多肽。然而，對(duì)于R35的具體功能還沒研究清楚，目前的研究顯示，R35是單拷貝基因，可能屬于一個(gè)新的G蛋白偶聯(lián)受體超家族。通過序列比對(duì)顯示，R35或許司職著G蛋白偶聯(lián)受體的作用，在小腦、骨髓、幼胚的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中進(jìn)行著發(fā)育的調(diào)節(jié)并高表達(dá)［21］。Friedel等［21］還指出R35基因有一段1000～2000 bp的內(nèi)含子。R35基因的這一段內(nèi)含子作為一種新的核內(nèi)基因標(biāo)記已被國外一些學(xué)者運(yùn)用到龜鱉類動(dòng)物的系統(tǒng)進(jìn)化研究中［7，22］。

本研究中運(yùn)用RAG2和R35這兩個(gè)核基因的數(shù)據(jù)來分析24種龜鱉類的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建的三種系統(tǒng)樹均具有較高的支持率，從而更好地佐證了龜鱉類科階元及更高分類階元的一些進(jìn)化關(guān)系。然而，研究龜鱉類的系統(tǒng)進(jìn)化和親緣關(guān)系是極其復(fù)雜的工作，還需要通過更多的線粒體(如線粒體全基因組)和核內(nèi)的分子數(shù)據(jù)相結(jié)合來做進(jìn)一步的分析。

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