乳酸菌固態(tài)混合發(fā)酵研究

方芳 張恒 賈建波 趙玉萍 張海寧 呂華清

生物飼料，即微生物飼料，是在微生態(tài)理論指導(dǎo)下采用已知有益的微生物與飼料混合，經(jīng)發(fā)酵、干燥等特殊工藝制成的含活性益生菌的安全、無(wú)污染、無(wú)殘留的優(yōu)質(zhì)飼料，與發(fā)酵前相比，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提高了，抗?fàn)I養(yǎng)因子減少了，對(duì)動(dòng)物有一定的促生長(zhǎng)作用，可以用來(lái)喂豬、魚(yú)、鴨等[1-3]。保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌由于具有調(diào)節(jié)腸道、促進(jìn)消化等功能,被眾多學(xué)者認(rèn)為是生產(chǎn)益生菌劑的理想菌種。目前對(duì)于這三種乳酸菌分別進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵的研究已有一些報(bào)道[4-5]，但對(duì)此進(jìn)行混菌固態(tài)發(fā)酵的研究還不多見(jiàn)[6]。因此本實(shí)驗(yàn)選用玉米粉、麥麩、豆粕這些市場(chǎng)上易購(gòu)的廉價(jià)飼料原料作為固態(tài)基質(zhì)，對(duì)這三種乳酸菌進(jìn)行固態(tài)混合發(fā)酵，優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵條件，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和氨基酸態(tài)氮含量，為開(kāi)發(fā)一種新型生物飼料打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

保加利亞乳桿菌 (Lactobacillus Bulgaria,以下簡(jiǎn)稱 LB)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus,以下簡(jiǎn)稱LA)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermopiles,以下簡(jiǎn)稱ST)由淮陰工學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、消化爐、定氮儀、分光光度計(jì)、索氏提取器等。

1.3 培養(yǎng)基

LB、LA和ST的活化用MRS液體培養(yǎng)基。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：①玉米粉：豆粕：麥麩=2：1：1；②玉米粉：豆粕：麥麩=1：2：1；③玉米粉：豆粕：麥麩=1：1：2；④玉米粉：豆粕：麥麩=1：1：1；均添加 5%的葡萄糖、MgSO4·7H2O 0.3 g、MnSO4·4H2O 0.15 g。

LB、LA和ST的活菌數(shù)測(cè)定采用BBL培養(yǎng)基，參照辛若竹等[7]的測(cè)定方法。

1.4 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

先對(duì)固態(tài)基質(zhì)4種不同配比、接種量（6%、8%、10%、12%）、培養(yǎng)基初始含水量（60%、70%、80%、90%）、培養(yǎng)基初始 pH 值（5.0、5.7、6.3、7.0）和發(fā)酵溫度（35、37、40、42℃）分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，再對(duì)后4個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)（因素水平見(jiàn)表1），以LB、LA和ST三種菌活菌數(shù)的平均值為指標(biāo)確定固態(tài)發(fā)酵條件的最佳組合[8-11]。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.5 發(fā)酵產(chǎn)物常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定[12-14]

粗蛋白含量的測(cè)定：采用凱氏定氮法；氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定：采用甲醛法；粗脂肪含量測(cè)定：采用索氏提取法。

2 結(jié)果與分析

2.1 固態(tài)基質(zhì)不同配比對(duì)混合菌種發(fā)酵影響

在每個(gè)三角瓶固態(tài)基質(zhì)總質(zhì)量為40 g，培養(yǎng)基初始含水量為70%、pH值為5.7、接種量為8%、LB、LA和ST接種比例為1：1：1、發(fā)酵溫度為37℃、靜置培養(yǎng)4 d的條件下，比較研究了固態(tài)基質(zhì)4種不同配比對(duì)乳酸菌固態(tài)混合發(fā)酵的影響。由圖1可以看出，LB、LA和ST的最適固態(tài)基質(zhì)配比分別為④、③、④。從綜合評(píng)分來(lái)看，三種菌混合固態(tài)發(fā)酵的最適固態(tài)基質(zhì)配比為④，其次為②、③、①。因此，當(dāng)玉米粉：豆粕：麥麩=1：1：1時(shí)，營(yíng)養(yǎng)配比最適于三種菌的共同生長(zhǎng)。

圖1 固態(tài)基質(zhì)不同配比對(duì)乳酸菌固態(tài)混合發(fā)酵的影響

2.2 接種量的選擇

圖2 接種量對(duì)乳酸菌固態(tài)混合發(fā)酵的影響

在玉米粉：豆粕：麥麩=1：1：1、培養(yǎng)基初始含水量為70%、pH值為5.7，LB、LA和ST接種比例為1：1：1、發(fā)酵溫度為37℃、靜置培養(yǎng)4 d的條件下，比較研究了不同的接種量對(duì)乳酸菌固態(tài)混合發(fā)酵的影響。由圖2可以看出,在接種量為6%時(shí)三種菌生長(zhǎng)都很少,隨著接種量的增加,三種菌基本都呈先增加后減少的趨勢(shì),且在接種量為10%時(shí)綜合評(píng)分達(dá)到最大值。因此,選擇10%為此固態(tài)發(fā)酵的最佳接種量。由此可見(jiàn)，在一定的接種量范圍內(nèi),增大接種量可使菌體數(shù)快速增長(zhǎng),增加發(fā)酵中的活菌數(shù),縮短發(fā)酵周期；但如果接種量太大,培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能滿足菌體生長(zhǎng)需要,進(jìn)而會(huì)限制菌體的生長(zhǎng)，使發(fā)酵后的活菌數(shù)減少[8]。

2.3 培養(yǎng)基初始含水量的選擇

在玉米粉：豆粕：麥麩=1：1：1、培養(yǎng)基初始pH值為5.7、接種量為10%，LB、LA和ST接種比例為1：1：1、發(fā)酵溫度為37℃、靜置培養(yǎng)4 d條件下，比較研究了培養(yǎng)基不同的初始含水量對(duì)乳酸菌固態(tài)混合發(fā)酵的影響。由圖3可以看出,隨著培養(yǎng)基初始含水量的增大,發(fā)酵后的三種菌數(shù)都呈先增加后減少的趨勢(shì),且都在含水量為80%時(shí)達(dá)到最大值。這是因?yàn)槿绻虘B(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基初始含水量過(guò)高,會(huì)使培養(yǎng)基黏度增大,導(dǎo)致培養(yǎng)基通透性降低,使菌體生長(zhǎng)緩慢;而含水量過(guò)低,則水分供應(yīng)不足,也會(huì)限制菌體的生長(zhǎng)繁殖,進(jìn)而影響發(fā)酵效果。因此,選擇80%的含水量作為三菌混合固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基最佳的初始含水量[8]。

圖3 培養(yǎng)基初始含水量對(duì)乳酸菌固態(tài)混合發(fā)酵的影響

2.4 培養(yǎng)基初始pH值的選擇

圖4 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)乳酸菌固態(tài)混合發(fā)酵的影響

在玉米粉：豆粕：麥麩=1：1：1、培養(yǎng)基初始含水量為80%、接種量為10%，LB、LA和ST接種比例為1：1：1、發(fā)酵溫度為37℃、靜置培養(yǎng)4 d條件下，比較研究了培養(yǎng)基不同的初始pH值對(duì)乳酸菌固態(tài)混合發(fā)酵的影響。不同微生物生長(zhǎng)所需的適宜pH值不同，LB生長(zhǎng)適宜pH值為5.8～6.2[10]，LA生長(zhǎng)適宜pH值為 5.5～6.2[8－9]，ST 生長(zhǎng)適宜 pH 值為 6.5～7.0[11]。由圖 4可以看出,LB和LA在pH值為5.7時(shí)分別達(dá)到最大值 3.2×109CFU/g和 4.9×109CFU/g，而 ST 則在 pH 值為6.3時(shí)達(dá)到最大值4.6×109CFU/g。通過(guò)綜合評(píng)分，選擇pH值5.7為三菌混合固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基最佳初始pH值。

2.5 發(fā)酵溫度的選擇

在玉米粉：豆粕：麥麩=1：1：1、培養(yǎng)基初始含水量為80%、pH值為5.7、接種量為10%，LB、LA和ST接種比例為1：1：1、靜置培養(yǎng)4 d條件下，比較研究了不同的發(fā)酵溫度對(duì)乳酸菌固態(tài)混合發(fā)酵的影響。不同微生物生長(zhǎng)所需的適宜溫度不同,LB生長(zhǎng)適宜溫度為 37～42 ℃[10]，LA 生長(zhǎng)適宜溫度為 35～37 ℃[8－9]，ST生長(zhǎng)適宜溫度為40～42℃[11]。由圖5可以看出，LB在40℃時(shí)達(dá)到最大值3.2×109CFU/g，LA在37℃時(shí)達(dá)到最大值4.9×109CFU/g，ST則在42℃時(shí)達(dá)到最大值5.7×109CFU/g。通過(guò)綜合評(píng)分，選擇溫度40℃為三菌混合固態(tài)發(fā)酵的最佳發(fā)酵溫度。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)乳酸菌固態(tài)混合發(fā)酵的影響

2.6 正交試驗(yàn)

以發(fā)酵后的活菌數(shù)為指標(biāo),在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在玉米粉：豆粕：麥麩=1：1：1、LB、LA和ST接種比例為1：1：1、靜置培養(yǎng)4 d的條件下，選擇接種量、培養(yǎng)基初始含水量、培養(yǎng)基初始pH值和發(fā)酵溫度4個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)（因素水平見(jiàn)表1），結(jié)果如表 2 所示。可以看出 RB＞RC＞RA＞RD，所以培養(yǎng)基初始含水量對(duì)于本試驗(yàn)的影響最顯著，其次是培養(yǎng)基初始pH值、接種量，最后是發(fā)酵溫度。通過(guò)綜合評(píng)分，得出最優(yōu)發(fā)酵方案為A2B3C3D2，即接種量10%、培養(yǎng)基初始含水量80%、pH值6.3、發(fā)酵溫度40℃。但是最優(yōu)發(fā)酵條件并沒(méi)有出現(xiàn)在9組試驗(yàn)中，為了證實(shí)理論分析，進(jìn)行補(bǔ)充試驗(yàn)。在此優(yōu)化方案下進(jìn)行乳酸菌固態(tài)混合發(fā)酵后，LB數(shù)達(dá)到3.0×109CFU/g,LA數(shù)達(dá)到 4.6×109CFU/g,ST 數(shù)達(dá)到 5.8×109CFU/g，都優(yōu)于其他小組，表明最優(yōu)發(fā)酵條件成立。

2.7 發(fā)酵產(chǎn)物常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定(見(jiàn)表3）

由表3可以看出，發(fā)酵后的固態(tài)基質(zhì)（玉米粉、麥麩和豆粕）中粗蛋白含量是發(fā)酵前的1.16倍，提高了基質(zhì)的蛋白質(zhì)水平，而且部分蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，改變了基質(zhì)蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)；氨基酸態(tài)氮含量是發(fā)酵前的6.94倍，可見(jiàn)乳酸菌的發(fā)酵作用能將基質(zhì)中的大分子蛋白降解為動(dòng)物更易消化吸收的小分子氨基酸，可明顯改善動(dòng)物對(duì)基質(zhì)的利用率[15]。此外，發(fā)酵后的固態(tài)基質(zhì)中粗脂肪含量是發(fā)酵前的1.12倍，提高了基質(zhì)的脂肪水平，能更好地滿足動(dòng)物對(duì)必需脂肪酸等脂肪類物質(zhì)的需求。

表2 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

表3 發(fā)酵前后固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分的比較

3 結(jié)論

通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化了LB、LA和ST這三種菌的混合發(fā)酵條件,得到固態(tài)發(fā)酵的最佳條件為：固態(tài)基質(zhì)中玉米粉：豆粕：麥麩=1：1：1、培養(yǎng)基初始含水量80%、pH 值6.3、接種量為10%，LB、LA和ST接種比例為1：1：1、發(fā)酵溫度40℃。在此最適條件下，LB 數(shù)為 3.0×109CFU/g,LA 數(shù)為 4.6×109CFU/g，ST 數(shù)為 5.8×109CFU/g。

LB、LA和ST混合發(fā)酵后,發(fā)酵產(chǎn)物中不僅含有大量益生菌,而且也使得發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)、氨基酸和粗脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量增多,使得混合發(fā)酵產(chǎn)物作為一種生物飼料產(chǎn)品的研制和產(chǎn)業(yè)化具有很好的前景。

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