降解玉米秸稈粗纖維擔(dān)子菌篩選及其應(yīng)用

張 卉 劉長江 薛景珍

隨著我國經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展和人民生活水平的提高，國民對畜產(chǎn)品的需求呈剛性增長。十二五期間，我國畜牧業(yè)產(chǎn)值占農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的比重將達(dá)36%。但畜牧資源特別是飼料資源將成為我國畜牧業(yè)發(fā)展的長期制約因素，飼料資源缺乏和成本上漲影響畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展。因此，我國迫切需要發(fā)展新型非常規(guī)飼料。其中玉米秸稈由于產(chǎn)量大、成本低、易收集等優(yōu)勢而具有廣闊的應(yīng)用前景。但由于秸稈蛋白質(zhì)含量低，其它營養(yǎng)成分又由粗纖維組成的細(xì)胞壁緊密包裹著，因而單胃動物不能消化。目前我國秸稈利用方式主要是經(jīng)氨化或青貯后部分飼喂反芻動物，少部分直接還田作肥料或焚燒掉，既浪費資源，又污染環(huán)境。秸稈作為飼料的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是粗纖維的降解，并將其纖維素類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)，從而提高其飼料利用率。迄今為止對于秸稈的降解已開發(fā)了化學(xué)處理、物理處理和微生物處理等技術(shù)。理化方法一般僅改善秸稈的質(zhì)地，粗纖維降解率很低，沒有蛋白質(zhì)的改變，因而其營養(yǎng)價值改變不大。微生物處理技術(shù)所利用的微生物中乳酸菌、酵母菌只能利用秸稈中的微量糖產(chǎn)酸及一定量菌體蛋白，提高適口性和采食量，但不能從根本上解決秸稈中纖維素類物質(zhì)分解這一關(guān)鍵問題。有些霉菌雖能分解纖維素，但存在霉菌毒素污染問題。只有擔(dān)子菌有望從根本上解決粗纖維降解問題。擔(dān)子菌是自然界有機(jī)質(zhì)循環(huán)的重要一環(huán)，尤其是纖維素、木質(zhì)素的主要分解菌。擔(dān)子菌中的白腐真菌是目前已知降解粗纖維能力最強(qiáng)的微生物，可將纖維素、木質(zhì)素徹底降解為二氧化碳和水。人類已有幾千年食用歷史的食用菌大多屬擔(dān)子菌亞門，它們的自然生長條件和人類的生產(chǎn)實踐、科學(xué)研究都證明它們具有降解粗纖維的能力。若利用食用菌生長過程中通過菌絲體產(chǎn)生的一系列胞外酶，把纖維素、木質(zhì)素等分解為低分子化合物，然后將其吸收并轉(zhuǎn)化為可供生物體吸收利用的菌體蛋白，將能極大地提高秸稈的營養(yǎng)價值和生物利用率。

本試驗探索利用擔(dān)子菌降解玉米秸稈粗纖維分解,并轉(zhuǎn)化為可供生物體吸收利用的菌體蛋白,并嘗試用此飼料部分代替非反芻動物日糧,為開發(fā)非常規(guī)飼料開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

平菇（Pleurotus ostreatus）、香菇（Lentinula edodes）、黑木耳（Auriculara auricula）等23種擔(dān)子菌，由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基配方

一級斜面培養(yǎng)基PDA（質(zhì)量分?jǐn)?shù)%）：葡萄糖2、瓊脂2、馬鈴薯20，pH值自然；

二級玉米粒培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)%）：玉米粒99.5、石膏粉0.5；

篩選培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)%）：秸稈粉5、瓊脂2。

秸稈發(fā)酵培養(yǎng)料配方（料水比為1：1.3）：

A.秸稈 100 kg，石膏 1 kg，石灰 1 kg；

B.配方A加麥麩10 kg；

C.配方A加玉米粉10 kg；

D.配方A加玉米粉10 kg，尿素0.5 kg；

E.配方A加玉米粉10 kg，磷酸二胺0.5 kg。

上述秸稈培養(yǎng)料裝入17 cm×33 cm耐壓聚乙烯塑料袋,121℃滅菌2 h，裝料量1 kg/袋。

1.2 方法

1.2.1 玉米秸稈菌化優(yōu)良菌種及其培養(yǎng)料配方篩選

通過二因素隨機(jī)區(qū)組試驗，以粗纖維分解率為主要指標(biāo)，篩選玉米秸稈菌化的擔(dān)子菌及培養(yǎng)料配方。因素A為培養(yǎng)料配方，因素B為菌種，一次重復(fù)。采用多元統(tǒng)計分析程序分析。

發(fā)酵條件：非控溫發(fā)酵，實際培養(yǎng)室溫11～24℃，濕度40%～60%，避光。

1.2.2 分析測定項目及方法

水分采用干燥恒重法；蛋白質(zhì)采用凱氏定氮法；粗纖維采用酸堿醇醚法；灰分采用灼燒法；粗脂肪采用索氏提取法；Ca采用高錳酸鉀滴定法；P采用釩鉬黃比色法；氨基酸采用氨基酸分析儀法；電鏡掃描采用日立 S－450。

1.2.3 雛雞飼喂增重試驗

家禽飼喂增重試驗在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院科研種雞場進(jìn)行。試驗選用初生海蘭商品代蛋用公雞雛50只，隨機(jī)分為5組，每組10只。各試驗組分別喂以不同日糧組成的飼料，按正常雛雞飼養(yǎng)程序進(jìn)行管理。試驗至雛雞滿3周齡結(jié)束，對照組飼喂全價飼料。

2 結(jié)果與分析

2.1 秸稈培養(yǎng)基上擔(dān)子菌菌絲生長情況

23種擔(dān)子菌中有4株在玉米秸稈粉為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長最好，具體生長情況及菌化后秸稈狀態(tài)見表1。

表1 4種擔(dān)子菌在玉米秸稈上菌絲生長情況及菌化秸稈狀態(tài)

由表1可見，秸稈經(jīng)擔(dān)子菌菌化后色香味均有較大改善。其中S－2號菌株萌動快，發(fā)菌充分需要時間短，其菌化料較對照組及其它菌化組色澤明顯變白。S－9、S－14號菌種萌動、發(fā)菌充分也較快。而作為對照的未菌化秸稈的顏色、風(fēng)味等感觀狀況不好。試驗所用的其他19種擔(dān)子菌因在1 kg玉米秸稈為唯一碳源培養(yǎng)基上長滿所需時間超過40 d或長勢不佳而被淘汰。

2.2 轉(zhuǎn)化菌種和秸稈培養(yǎng)料配方篩選結(jié)果

將在玉米秸稈粉為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長良好的4株擔(dān)子菌在5種秸稈培養(yǎng)料上進(jìn)行二因素隨機(jī)區(qū)組菌化試驗。菌化后測定各區(qū)組菌化秸稈樣品及對照組的粗纖維含量，結(jié)果見表2。為確定每種培養(yǎng)基、菌種對粗纖維降解率的影響，分別用新復(fù)極差法對二者進(jìn)行了最小顯著極差(LSR)檢驗，結(jié)果見表3和表4。

由表3可見，秸稈培養(yǎng)料A與C、D、E相比對于粗纖維降解率皆有極顯著差異(P＜0.01)，與培養(yǎng)料配方B比差異顯著(P＜0.05)；培養(yǎng)料配方D、E降解效果最差，表明培養(yǎng)基中加入尿素，磷酸二銨等氮源不利于粗纖維的降解，而且基質(zhì)中氮素含量增加與粗纖維降解率呈負(fù)相關(guān)。

由表 4 可見，菌種 S－2、S－9 與菌種 S－14、S－13 相比對于粗纖維降解有極顯著差異 (P＜0.01),S－2、S－9菌種間無顯著性差異(P＞0.05)，表明 S－2、S－9 為降解粗纖維能力強(qiáng)的優(yōu)良菌株。

表2 培養(yǎng)料及菌種二因素隨機(jī)區(qū)組試驗結(jié)果

表3 培養(yǎng)料配方對粗纖維降解率LSR檢驗結(jié)果

表4 菌種對粗纖維降解率LSR檢驗結(jié)果

上述試驗表明，秸稈培養(yǎng)料A接種S－2或S－9菌株為最佳組合是有利于粗纖維降解。其中S－2菌株為平菇（Pleurotus ostreatus），早在 20世紀(jì) 90年代，一些研究者就開始利用平菇降解農(nóng)作物秸稈的研究，如Kerem(1992)進(jìn)行了平菇固態(tài)發(fā)酵棉花秸稈降解木質(zhì)纖維素的試驗,取得了較好的效果；(1998)[10]利用菌絲體發(fā)酵麥秸120 d，麥秸的中性洗滌纖維從824 g/kg降低到485 g/kg,酸性洗滌纖維從561 g/kg降低到412 g/kg。此外，科學(xué)家們還發(fā)現(xiàn)平菇除了具有降解粗纖維的能力，平菇中的一些物質(zhì)還具有重要的生理活性。Paulík等(1996)就發(fā)現(xiàn)平菇子實體含有可溶性葡聚糖對小鼠具有免疫調(diào)節(jié)活性；KurashigeS等(1997)發(fā)現(xiàn)平菇子實體提取物具有抑制癌癥、促進(jìn)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞活性作用；Sarangi等(2006)發(fā)現(xiàn)平菇的菌絲體所含的蛋白聚糖也具有免疫調(diào)節(jié)活性；而 Miguel(1997)、Hearst等(2009)，發(fā)現(xiàn)，平菇中的某些成分具有抗細(xì)菌和抗真菌的作用。因此，本文對S－2菌株轉(zhuǎn)化玉米秸稈進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.3 菌化秸稈營養(yǎng)成分分析

S－2菌株菌化后的玉米秸稈的主要營養(yǎng)成分及氨基酸分析結(jié)果見表5及表6。

表5 玉米秸稈發(fā)酵前后營養(yǎng)成分比較

表6 發(fā)酵秸稈氨基酸含量

由表5和表6可見，經(jīng)S－2菌株發(fā)酵后秸稈的粗纖維含量下降了30.5%，而粗蛋白增加了31.3%，粗脂肪提高25.0%。此外，經(jīng)S－2菌株發(fā)酵后秸稈的氨基酸種類豐富，達(dá)16種(色氨酸未測)。這些營養(yǎng)成分的變化，使玉米秸稈的營養(yǎng)價值大幅度提高，尤其是粗纖維含量的降低對于提高玉米秸稈的消化利用率有重要意義。

2.4 菌化秸稈電鏡觀察結(jié)果

為研究菌化后玉米秸稈組織結(jié)構(gòu)變化，本試驗將未處理混合料及擔(dān)子菌S－2轉(zhuǎn)化作用后的菌化料分別進(jìn)行表面電鏡掃描，結(jié)果見圖1和圖2(放大倍數(shù)1： 600)。由圖1、圖2可見，未菌化的秸稈細(xì)胞壁完整，組織結(jié)構(gòu)清晰可辨。而經(jīng)S－2擔(dān)子菌固態(tài)發(fā)酵后的秸稈細(xì)胞結(jié)構(gòu)有不同程度破壞，細(xì)胞間隙及表面產(chǎn)生大量絮狀菌絲體。

圖1 未處理秸稈表面狀態(tài)

圖2 S－2擔(dān)子菌發(fā)酵后秸稈表面狀態(tài)

2.5 菌化秸稈對雛雞飼養(yǎng)效果的研究

菌化秸稈替代部分日糧試驗選用初生海蘭商品代蛋用公雞雛作為試驗動物，按正常雛雞飼養(yǎng)程序進(jìn)行管理，試驗至雛雞滿3周齡結(jié)束。試驗組及對照組日糧組成及試驗期內(nèi)雛雞采食、排便情況見表7，雛雞增重情況見表8，數(shù)據(jù)處理結(jié)果見表9。

表7 不同日糧組成雛雞喂養(yǎng)效果

表8 雛雞增重效果

表9 雛雞增重LSR檢驗結(jié)果

由表7至表9可見，不同日糧組成的試驗組間雛雞的采食、排便情況和增重效果差異顯著。第1、2、4組雛雞出現(xiàn)不同程度稀便，采食量下降情況，且增重效果與對照組比均有極顯著差異（P＜0.01）。第3組，即用S－2菌體蛋白飼料代替5%配合飼料飼養(yǎng)的雛雞采食、排便情況正常，3周增重效果與對照組無顯著性差異（P＞0.05）。上述試驗結(jié)果說明，擔(dān)子菌S－2菌體蛋白飼料有可能代替5%全價配合飼料用于雛雞飼養(yǎng)，但還需進(jìn)行較長飼養(yǎng)周期的試驗來進(jìn)一步確證。未菌化秸稈粉部分代料飼養(yǎng)雛雞不可行。

3 結(jié)論

3.1 對于玉米秸稈粗纖維降解率，5種秸稈培養(yǎng)料配方間及4種擔(dān)子菌菌種間均有極顯著差異；菌種與培養(yǎng)料交互作用間有極顯著差異。最佳組合為培養(yǎng)料A接種S－2菌株。

3.2 擔(dān)子菌S－2菌株發(fā)酵后秸稈與未菌化料相比粗纖維含量下降了30.5%，粗蛋白增加了31.3%，粗脂肪提高25.0%，氨基酸達(dá)16種(色氨酸未測)，提高了秸稈的營養(yǎng)價值。

3.3 擔(dān)子菌S－2菌體蛋白飼料有可能代替5%配合飼料飼喂雛雞。

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