葛圣林，彭磊磊，張成鑫

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟血管外科，安徽合肥 230022)

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+T細(xì)胞)是一類具有免疫抑制功能的細(xì)胞，在正常機(jī)體維持T淋巴細(xì)胞動態(tài)平衡和免疫耐受機(jī)制中扮演重要角色。由于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞具有免疫抑制這種特殊功能，可能為抑制免疫排斥反應(yīng)及誘導(dǎo)免疫耐受開辟一條新的道路，因此受到各國器官移植學(xué)家的極大關(guān)注。Foxp3是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性功能基因，其在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表型、發(fā)育和功能中起決定性作用［1－2］。Foxp3的調(diào)控受多種細(xì)胞因子(如 CD28、IL-2、CTLA-4和TGF-β等)及TCR信號的影響，與磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶體蛋白(PI3K-Akt-mTOR)信號通路之間有無聯(lián)系目前鮮有報道。本實驗將研究PI3K-Akt-mTOR信號通路對Foxp3基因表達(dá)的影響并探討兩者之間是否具有相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級昆明系小鼠60只，♂性，體重(20±2)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。

1.2主要藥物及試劑雷帕霉素(rapamycin，RAPA)購自福建科瑞藥業(yè)有限公司(產(chǎn)品批號:080601);FITC標(biāo)記的抗小鼠CD4單克隆抗體及匹配的同型對照(Cat:BM0401，Lot:E033698)，PE 標(biāo)記的抗小鼠CD25單克隆抗體及匹配的同型對照(Cat:EM2504，Lot:E021463)購自美國 ebioscience公司，兔抗小鼠p-mTOR(S2448)單克隆抗體購自美國Bioworld公司(Cat:BS4706)，免疫組織化學(xué)SP法染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，TRIzol溶液購自美國 Invitrogen公司(Cat:1401902)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國 Promega公司(Cat:261785)。

1.3主要儀器EPICS XL-MCL(4C)型流式細(xì)胞儀(美國Beckman-Coulter公司生產(chǎn))，Z-300型低速臺式離心機(jī)(德國HERMLE公司生產(chǎn))，顯微鏡(Nikon，ECLIPSE 80i，Japan)，形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(JEDR 801D)，Tgradient PCR儀(德國Biometra公司生產(chǎn))。

1.4實驗方法將60只小鼠隨機(jī)分為對照組和實驗組，每組15只，飼養(yǎng)在SPF級飼養(yǎng)柜中，飲用水和飼料均經(jīng)滅菌處理。根據(jù)小鼠和人實驗劑量換算關(guān)系，按照成人的維持治療劑量2 mg·d－1，實驗組(C)每只小鼠灌胃 RAPA 0.4 mg·d－1［3］，實驗組(B、D)分別用較低劑量(0.2 mg·d－1)和較高劑量(0.6 mg·d－1)RAPA灌胃，對照組(A)每天予以無菌生理鹽水灌胃，共3周。戊巴比妥腹腔注射麻醉，無菌條件下心臟采血，EDTA抗凝，用于流式細(xì)胞儀檢測;分離脾臟，取1/2研磨，過200目金屬濾網(wǎng)，RPMI 1640培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，制備脾細(xì)胞懸液1010·L－1;另 1/2脾臟用于 Foxp3 mRNA RT-PCR及P-mTOR蛋白的測定。

1.5CD4+CD25+T細(xì)胞的百分比測定分別取100 μl EDTA抗凝血和脾細(xì)胞懸液，加入5 μl FITC標(biāo)記的抗小鼠CD4單克隆抗體及5 μl PE標(biāo)記的抗小鼠CD25單克隆抗體，混勻后室溫避光孵育30 min，加入溶血劑后室溫放置10 min至透明，2 000 r·min－1離心5 min，棄上清，PBS再洗滌2次，加入500 μl PBS混勻，上流式細(xì)胞儀檢測。同時設(shè)立相應(yīng)的同型對照管。

1.6P-mTOR蛋白的測定及結(jié)果評定標(biāo)準(zhǔn)實驗步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟，梯度酒精水化，0.01 mol·L－1(pH 7.2)枸櫞酸鹽緩沖液修復(fù)抗原，用3%H2O2去離子水室溫孵育10 min，PBS液沖洗3次，滴加山羊血清工作液室溫孵育30 min后加入一抗(p-mTOR工作液濃度為1∶100)后4℃過夜，PBS液沖洗3次，滴加生物素化二抗工作液后室溫孵育30 min，PBS液沖洗3次，DAB顯色，自來水充分沖洗，封片，鏡檢。陽性對照采用已知陽性片為標(biāo)準(zhǔn)，陰性對照采用PBS液代替一抗為標(biāo)準(zhǔn)，其余步驟相同。P-mT0R蛋白主要表達(dá)于胞質(zhì)，陽性染色為淺黃色、棕黃色或棕褐色。采用JEDR 801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對P-mT0R蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野(×400)，測定每個視野下陽性反應(yīng)的平均光密度。以每例5個視野的平均光密度的平均值作為該例的測量值。

1.7Foxp3 mRNA RT-PCR測定取100 mg脾臟組織，用 TRIzol法常規(guī)提取淋巴細(xì)胞總 RNA，F(xiàn)oxp3 mRNA特異引物做RT-PCR反應(yīng)，引物由美國Invitrogen公司設(shè)計與合成。擴(kuò)增目的基因在瓊脂糖凝膠上電泳，上游物:5'-ACACCCAGGAAAGACAGC-3'，下游引物:5'-CGAACATGCGAGTAAACC-3'，擴(kuò)增片段592bp。在紫外分析儀上觀察結(jié)果，同時設(shè)Beta-actin作為內(nèi)參照，擴(kuò)增片段上游引物:5'-GACCTTCAACACCCCAG-3'，下 游 引 物:5'-GTCACGCACGATTTCCC-3'，擴(kuò)增片段259bp。凝膠掃描成像系統(tǒng)記錄電泳結(jié)果。采用Imagemaster VDS(Pharmacia Biotech)圖像分析軟件分析光密度值，以Foxp3/β-actin光密度比值來表示Foxp3mRNA表達(dá)水平。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示。4組間比較采用單因素方差分析，同時采用LSD法進(jìn)行兩兩比較;關(guān)聯(lián)分析用Spearman秩相關(guān)分析。Foxp3mRNA和p-mTOR蛋白兩指標(biāo)之間用pearson相關(guān)分析其是否具有相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1CD4+CD25+T細(xì)胞百分比實驗組(B、C、D)小鼠外周血和脾細(xì)胞中CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平分別為(9.62±1.43、13.76±1.97、15.41±2.45)%和(12.23±4.56、23.03±6.18、25.17±6.42)%，對照組(A)小鼠外周血和脾細(xì)胞中 CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平分別為(3.52±0.65)%和(6.53±3.01)%，無論是在外周血還是脾細(xì)胞中，B、C、D組CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平明顯高于A組(P＜0.05)，C、D組與B組之間CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平也有差異(P＜0.05)，C組和D組之間CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平無差異(P＞0.05)，見Tab 1。

Tab 1 Proportion of CD4+CD25+Treg cells in peripheral blood and spleen cells of mice(% ，±s)

Tab 1 Proportion of CD4+CD25+Treg cells in peripheral blood and spleen cells of mice(% ，±s)

In peripheral blood，the comparison among four groups general F=39.971，P=0.000;*P ＜0.05 vs B;#P ＜0.05 vs A.Spearman rank correlation:r=0.749，P ＜0.01In spleen cells，the comparison among four groups general F=30.775，P=0.000.Spearman rank correlation:r=0.762，P ＜0.01

Group Peripheral blood Spleen(A)Normal saline 3.52 ±0.65 6.53 ±3.01(B)RAPA 0.2 mg·d－1 9.62 ±1.43# 12.23 ±4.56#(C)0.4 mg·d－1 13.76 ±1.97*# 23.03 ±6.18*#(D)0.6 mg·d－1 15.41 ±2.45*# 25.17 ±6.42*#

2.2P-mTOR蛋白在脾臟中的表達(dá)P-mT0R蛋白的陽性表達(dá)主要位于脾細(xì)胞胞質(zhì)，圖像分析結(jié)果顯示，實驗組(B、C、D)小鼠脾臟中P-mT0R蛋白表達(dá)的平均光密度分別為(0.2326±0.0431、0.1156±0.0223、0.0556±0.0041)，對照組 A 為(0.4223 ±0.0534)，B、C、D組平均光密度均明顯低于A組(P＜0.05)，C、D組與B組之間平均光密度也有差異(P＜0.05)，C組和D組之間平均光密度無差異(P＞0.05)，見 Fig 1及 Tab 2。

2.3Foxp3表達(dá)實驗組(B、C、D)小鼠脾臟中Foxp3/β-actin光密度比值分別為(0.4853±0.0574、0.7886 ±0.1085、0.9639 ±0.2015)，對照組A為(0.1345±0.0271)，見Fig 2及Tab 2。

3 討論

PI3K-Akt-mTOR信號通路參與細(xì)胞增殖、凋亡和分化等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，此信號通路激活后可促進(jìn)細(xì)胞周期運(yùn)行，使細(xì)胞增殖，過度激活可使細(xì)胞生存與凋亡失衡，正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，惡性腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是Akt的下游信號，是調(diào)控PI3K/Akt途徑的關(guān)鍵因子［4］，在細(xì)胞的增殖、分化過程中起著中心調(diào)控點(diǎn)的作用［5－6］。mTOR 通過PI3K-Akt途徑被Akt直接磷酸化而激活，其磷酸化形式(p-mTOR)是mTOR在PI3K-Akt-mTOR信號通路中的激活狀態(tài)，研究顯示mTOR的ser2448磷酸化，是mTOR信號通路被激活的生物學(xué)標(biāo)志，而總mTOR卻不能很好反映mTOR信號通路的激活狀態(tài)［7－8］，因此本實驗選取 p-mTOR(ser2448)蛋白作為研究指標(biāo)。激活的mTOR隨后磷酸化它的兩個下游分子(4E-BP1、p70S6K)，使細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)［9］。雷帕霉素是mTOR的特異抑制劑，RAPA進(jìn)入細(xì)胞后在細(xì)胞質(zhì)中首先與FK506結(jié)合蛋白(FKBP)結(jié)合形成FKBP12-RAPA復(fù)合物，此復(fù)合物再與mTOR氨基酸殘基2025-2114區(qū)結(jié)合導(dǎo)致mTOR不能被磷酸化，從而抑制mTOR的生物學(xué)功能。研究表明RAPA可以促進(jìn)CD4+CD25+Treg細(xì)胞增長并維持其功能，同時減少 CD4+CD25-效應(yīng)性 T細(xì)胞(effector T cell，Teff)的數(shù)量［10－11］，因此深入研究mTOR及其信號通路，可能會為誘導(dǎo)免疫耐受提供新的思路和方法。

Fig 1 Expression of protein p-mTOR in spleen cells of mice

Fig 2 Expression of Foxp3 mRNA in spleen cells of mice

Tab 2 Expression of Foxp3 mRNA and protein p-mTOR in spleen cells of mice(%，±s)

Tab 2 Expression of Foxp3 mRNA and protein p-mTOR in spleen cells of mice(%，±s)

For average optical density of p-mTOR，the comparison among four groups general F=19.875，P=0.000.Spearman rank correlation:r= －0.968，P ＜0.01For the ratio of optical density between Foxp3 and β-ctin，the comparison among four groups general F=12.139，P=0.000;#P ＜0.05 vs A:*P ＜0.05 vs B.Spearman rank correlation:r=0.868，P ＜0.01Two index about average optical of p-mTOR and the ratio of optical density between Foxp3 and β-actin were analysized by Pearson rank correlation:r= －0.993，P＜0.01

Group Foxp3/β-actin Average optical density of p-mTOR(A)Normal saline 0.1345 ±0.0271 0.4223 ±0.0534(B)RAPA 0.2 mg·d －1 0.4853 ±0.0574# 0.2326 ±0.0431#(C)0.4 mg·d －1 0.7886 ±0.1085#*0.1156 ±0.0223#*(D)0.6 mg·d －1 0.9639 ±0.2015#*0.0556 ±0.0041#*

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在RAPA 3種使用劑量情況下，隨著RAPA使用劑量逐步加大，p-mTOR的陽性率逐漸降低，說明PI3K-Akt-mTOR信號通路不同程度地被RAPA所抑制;同時，F(xiàn)oxp3 mRNA的表達(dá)也不同程度地增強(qiáng)，CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比逐漸增高。對外周血及脾細(xì)胞中CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平均進(jìn)行Spearman秩相關(guān)分析，結(jié)果顯示CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平與RAPA給藥劑量呈正相關(guān)(外周血組:r=0.749，P＜0.01;脾細(xì)胞組:r=0.762，P＜0.01)，說明在一定的RAPA給藥劑量范圍內(nèi)可以通過增加其給藥劑量來提高CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比。雖然C組和D組之間無差異，但D組較C組也有增高的趨勢，可能在進(jìn)一步增大RAPA的給藥劑量后就會表現(xiàn)出差異。通過對Foxp3mRNA和p-mTOR蛋白兩指標(biāo)(Foxp3/β-actin光密度比值及平均光密度)之間相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)二者之間存在負(fù)相關(guān)(r=－0.993，P＜0.01)，p-mTOR蛋白表達(dá)的平均光密度隨著雷帕霉素用量的增加而降低說明PI3K-AktmTOR信號通路被逐步的抑制，爾后Foxp3mRNA的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，由此我們可以推出抑制PI3K-AktmTOR信號通路可以使Foxp3的表達(dá)增強(qiáng)，且Foxp3的表達(dá)程度與PI3K-Akt-mTOR信號通路的激活程度呈負(fù)相關(guān)。

在以往的研究中，人們逐漸發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路在調(diào)控天然免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中起著重要作用。雖然抑制mTOR在一些免疫抑制試驗計劃中得到開發(fā)，但RAPA在體內(nèi)的免疫抑制機(jī)制仍然不明確。目前，科學(xué)家已對PI3K-Akt-mTOR信號通路和Treg細(xì)胞生長分化之間的關(guān)系給出自己的觀點(diǎn)，F(xiàn)euerer等［12］認(rèn)為激活 PI3K-Akt-mTOR信號通路會抑制 Treg細(xì)胞的分化，Strauss等［13］也認(rèn)為 PI3KAkt-mTOR信號通路在CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞生長分化中起著重要作用。通過本實驗可發(fā)現(xiàn)抑制PI3K-Akt-mTOR信號通路會促使CD4+CD25+Treg細(xì)胞特異性基因Foxp3的表達(dá)增強(qiáng)，最終影響小鼠體內(nèi)CD4+CD25+Treg細(xì)胞含量的不同，這為我們進(jìn)一步研究RAPA誘導(dǎo)Foxp3表達(dá)的具體機(jī)制提供了一條新的思路，此外mTOR已經(jīng)被確定是PI3KAkt的下游靶點(diǎn)，抑制PI3K-Akt-mTOR信號通路的這一成分，對于我們在臨床工作中誘導(dǎo)免疫耐受也具有積極意義。

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