付再林，宋必衛(wèi)，施水娟，楊 毅

(浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 310014)

線粒體(mitochondria，MT)是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化主要場所，在維持細(xì)胞生命活動(dòng)中起著極為重要的作用。MT的損傷可致細(xì)胞能量供應(yīng)中斷，MT內(nèi)Ca2+超載，細(xì)胞內(nèi)自由基水平升高，MT膜屏障功能減低甚至喪失，膜通透性增加、跨膜電位降低、細(xì)胞色素C釋放等并激活下游凋亡信號通路［1－2］。這些改變將直接或間接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡(apoptosis)和壞死(necrosis)［3］。大量細(xì)胞急性死亡是臨床危、重、急癥如急性肝衰竭、中風(fēng)等病的共同病理基礎(chǔ)，持續(xù)的細(xì)胞死亡是許多慢性疾病如帕金森病、老年性癡呆的發(fā)病且不斷惡化的原因［4］。盡管在細(xì)胞死亡機(jī)制研究方面已有長足進(jìn)步，但目前仍然缺乏減少細(xì)胞死亡的有效藥物，搶救瀕危細(xì)胞以挽回生命的藥物為臨床亟需。

鈣超載是公認(rèn)的細(xì)胞損傷、死亡的共同環(huán)節(jié)［5］。理論上，迅速降低細(xì)胞內(nèi)鈣，消除鈣超載，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞死亡進(jìn)程，是挽救瀕危細(xì)胞可行手段。BAPTA-AM［1，2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N，N，N'N'-tetraacetic acid］是一種進(jìn)入細(xì)胞后活化的高效鈣絡(luò)合劑，廣泛用于控制細(xì)胞內(nèi)鈣水平［5］。本研究以H2O2損傷HepG-2細(xì)胞，通過測定MT膜電位、細(xì)胞色素C的釋放、Caspase-9及 ROS的激活等，觀察BAPTA-AM對MT的保護(hù)作用，探討其可能的作用機(jī)制，期望發(fā)現(xiàn)一種強(qiáng)有力的搶救瀕危細(xì)胞藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑HepG-2細(xì)胞株購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;BAPTA-AM由合肥恒星藥物研究所提供;Rhodamine123、MTT購自Sigma公司;細(xì)胞色素C(CytC)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒，購自Uscn-life公司;Caspase-9活性檢測試劑盒、活性氧ROS檢測試劑盒購自海門市碧云天生物技術(shù)研究所;RPMI 1640培養(yǎng)液、小牛血清、0.25%胰蛋白酶購自上海吉諾醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司。

1.1.2儀器垂直流超凈臺(tái)(ESCO，SCV-4A1);CO2培養(yǎng)箱(Thermo Electron，F(xiàn)orma 3111);熒光顯微鏡(Leica Devices);酶標(biāo)儀(Molecular Devices，Spectramax M2e);離心機(jī)(Heraeus，LDZ5-2)。

1.2 方法

1.2.1H2O2誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞損傷模型的建立［6－7］將細(xì)胞以 104/孔接種于 96 孔板，RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)至細(xì)胞生長到70%～80%孔面積。加入終濃度 500 μmol·L－1的 H2O2，分別培養(yǎng) 0、3、6、9、12、15和 24 h，每組設(shè) 8 個(gè)復(fù)孔。MTT 法檢測細(xì)胞活力:終止培養(yǎng)后加終濃度0.5%的MTT，37℃孵育4 h后DMSO溶解，酶標(biāo)儀(λ=570 nm)記錄各孔吸光度。

1.2.2BAPTA-AM對H2O2誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞損傷的影響細(xì)胞分為正常對照組、H2O2損傷組、BAPTA-AM(10－8－10－5mol·L－1)4 個(gè)保護(hù)組。每組8個(gè)復(fù)孔。保護(hù)組分別加入相應(yīng)濃度的BAPTA-AM培養(yǎng)1 h后，模型組和各保護(hù)組均加入500 μmol·L－1H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)9 h，MTT法檢測細(xì)胞活力。

1.2.3MT膜電位(MMP)的檢測［6－7］Rh 123 為膜電位敏感的親脂性陽離子熒光染料，能選擇性地在活細(xì)胞MT內(nèi)聚集，發(fā)出黃綠色熒光，其強(qiáng)度可以間接反映MT膜電位(MMP)的高低。細(xì)胞接種、分組與處理同“1.2.2”，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。棄培養(yǎng)液，PBS清洗兩次后加含100 μg·L－1Rh 123的無血清培養(yǎng)基中37℃孵育45 min，棄培養(yǎng)液，PBS清洗多次至背景較淺，熒光顯微鏡觀察、拍照。

1.2.4胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素C(CytC)含量測定［6－7］細(xì)胞接種于6孔板中，分組與處理同“1.2.2”，收集細(xì)胞，PBS稀釋使細(xì)胞濃度達(dá)到200萬·ml－1。通過液氮反復(fù)凍融破壞細(xì)胞以釋放出細(xì)胞內(nèi)成份，離心10 min(10 000 r·min－1)收集上清，ELISA法測定CytC含量(按試劑盒說明書操作)。

1.2.5細(xì)胞內(nèi)Caspase-9活性檢測［6－7］細(xì)胞接種、分組與處理同“1.2.4”，收集細(xì)胞，按每200萬細(xì)胞加入100 μl的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴中裂解 15 min，4℃ 離心 15 min(15 000 r·min－1)。按試劑盒說明書檢測Caspase-9催化底物Ac-LEHD-pNA(acetyl-Leu-Glu-His-Asp p-nitroanilide)產(chǎn)生的黃色pNA量，405 nm測定pNA吸光度確定Caspase-9的活性。

1.2.6細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)含量的測定［8］2'，7'-二氯熒光乙酰乙酸鹽(DCFH-DA)進(jìn)入細(xì)胞后被胞內(nèi)酯酶水解成不能透過細(xì)胞膜的DCFH，從而將探針載入胞內(nèi)。胞內(nèi)ROS可將無熒光的DCFH氧化成發(fā)出綠色熒光的DCF。其熒光的強(qiáng)弱可以間接反映細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。同“1.2.2”分組與處理，PBS清洗細(xì)胞兩次，加 10 μmol·L－1DCFH-DA，37℃孵育30 min，棄 DCFH-DA，PBS清洗多次至背景較淺，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 GraphPad Prism 5.0軟件，數(shù)據(jù)用±s表示，用One-way或Two-way ANOVA檢測均數(shù)差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 BAPTA-AM明顯提高受H2O2攻擊的HepG-2細(xì)胞活力H2O2作用細(xì)胞9 h，細(xì)胞活力僅為正常對照組的56.1%(Fig 1)。BAPTA-AM濃度依賴性地減輕細(xì)胞損傷，在10－6mmol·L－1時(shí)效果最佳(活力為93.4%)，再增大劑量則作用有所減弱。

Fig 1 BAPTA-AM protects HepG-2 cells against H2O2-induced injury(MTT method，±s，n=8).

2.2 BAPTA-AM抗H2O2所致的MMP降低由Fig 2可見，H2O2攻擊9 h使MT攝取Rh123能力降至正常細(xì)胞的7%，MMP崩潰。BAPTA-AM濃度依賴性防止MT對Rh123的攝取能力的潰損，濃度為10－6mol·L－1時(shí)作用最佳(與“2.1”結(jié)果一致)，表明BAPTA-AM能有效減輕H2O2所致的MT損傷，穩(wěn)定MMP，維持膜功能。

2.3BAPTA-AM明顯抑制CytC的釋放由Fig 3A可知H2O2攻擊下胞質(zhì)內(nèi)CytC明顯增加(由MT釋放)，12 h時(shí)累積量最大。隨著損傷時(shí)間延長，細(xì)胞大量死亡、殘留細(xì)胞少，故24 h測得的CytC量很低，因此以損傷12 h為觀察藥效時(shí)間點(diǎn)。BAPTAAM明顯抑制 CytC的釋放(Fig 3B)，濃度為10－6mol·L－1時(shí)作用最佳，增加濃度作用反而減弱，與上述結(jié)果一致。

2.4BAPTA-AM防止Caspase-9激活Caspase-9的激活可反映出以MT為核心的內(nèi)源性凋亡通路的激活程度。由Tab 1可知Caspase-9活性隨時(shí)間延長而增高，6～12 h模型組Caspase-9催化產(chǎn)生的pNA量與正常對照組比較差異有顯著性，表明損傷已激活Caspase-9，BAPTA-AM明顯抑制Caspase-9激活，10－7mol·L－1時(shí) Caspase-9 的活性已近正常對照組水平，隨著濃度增加 Caspase-9的活性可降低至正?；A(chǔ)值以下。

Tab 1 BAPTA-AM prevents the activation of caspase-9 induced by H2O2attack in HepG-2 cells(n=3)

Fig 2 Mitochondrial membrane potential(MMP)labeled with rhodamine123 and detected by fluorescence microscope.BAPTAAM protects mitochondrial membrane against MMP drop induced by H2O2injury.

2.5BAPTA-AM抑制ROS的產(chǎn)生由Fig 4可見細(xì)胞損傷(模型組)大量生成ROS，BAPTA-AM濃度依賴性減少ROS的產(chǎn)生，從而抑制ROS對細(xì)胞的損傷。

3 討論

Fig 3 Inhibitory effect of BAPTA-AM on cytochrome C(CytC)release from mitochondria induced by H2O2attack(±s，n=3).

MT和Ca2+超載在細(xì)胞死亡中的作用 MT是細(xì)胞有氧代謝中心和能量供應(yīng)站，也是ROS產(chǎn)生中心。MT結(jié)構(gòu)和功能的完整是細(xì)胞正常生命活動(dòng)的前提。缺血缺氧致代謝和能量障礙、炎癥、化學(xué)毒性攻擊等損傷因素均可損傷MT。能量障礙使離子轉(zhuǎn)運(yùn)失常，形成Ca2+超載。Ca2+超載的危害:(1)刺激ROS過度生成，攻擊膜、蛋白質(zhì)、核酸，致細(xì)胞損傷并加重鈣超載，形成惡性循環(huán);(2)MT電子傳遞和ATP生成脫偶聯(lián)，加重能量障礙;(3)Ca2+和ROS共同作用，在MT內(nèi)膜形成通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)，膜通透性高，造成MT腫脹，ATP耗竭，膜電位降低，引起細(xì)胞凋亡和壞死;同時(shí)MT外膜形成大孔徑的凋亡誘導(dǎo)通道(mitochondrialapoptosis-induced channel，MAC)，CytC經(jīng)此通道釋放到細(xì)胞質(zhì)，與Apaf-1蛋白結(jié)合后，再寡聚成凋亡小體，激活Caspase-9，始動(dòng)凋亡后期Caspases級聯(lián)反應(yīng)［9］。(4)直接或間接激活蛋白酶、核酸內(nèi)切酶，如使細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白、核酸水解，細(xì)胞死亡［1］。(5)其它作用:例如Ca2+通過Calpain激活Caspase-12，啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡(apoptosis by ER stress)通路，通過促進(jìn)ROS產(chǎn)生，激活應(yīng)激致活蛋白激酶JNK信號通路產(chǎn)生凋亡與壞死(TNF-α-死亡受體信號亦參與該通路激活)等［10］。由于Ca2+可通過多種離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、內(nèi)源儲(chǔ)庫釋放、直接通過損傷的膜等多種途徑進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，Tymianski等認(rèn)為必須采用多種阻滯藥聯(lián)合應(yīng)用才能阻斷Ca2+內(nèi)流以保護(hù)細(xì)胞。

Fig 4 BAPTA-AM blocks the generation of ROS in HepG-2 cells induced by H2O2attack.

BAPTA-AM的優(yōu)勢［11］:(1)目前臨床可用的鈣拮抗劑只能選擇性阻滯Ca2+自某一亞型鈣通道內(nèi)流，并且對已形成的細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載無作用，難當(dāng)抗細(xì)胞死亡重任。(2)細(xì)胞凋亡、壞死機(jī)制復(fù)雜，涉及的信號通路和信號分子很多，僅阻斷某一環(huán)節(jié)對改善全局幫助不大。(3)Ca2+超載在多環(huán)節(jié)參與細(xì)胞死亡信號過程。理論上，直接降低［Ca2+］i，迅速消除Ca2+超載，恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，可在多環(huán)節(jié)協(xié)同產(chǎn)生高效有益作用，是目前最佳可選策略。(4)BAPTA-AM是一種快速高效的細(xì)胞內(nèi)Ca2+絡(luò)合劑，有效控制［Ca2+］i。是迅速消除Ca2+超載的最佳選擇。

基于以上觀點(diǎn)，我們致力于BAPTA-AM抗細(xì)胞損傷作用的研究，證實(shí)其確能多環(huán)節(jié)抗細(xì)胞死亡，結(jié)果令人興奮:(1)BAPTA-AM能有效消除Ca2+超載［11］，抗D-氨基半乳糖所致的肝細(xì)胞凋亡與壞死。細(xì)胞損傷后，［Ca2+］i明顯升高;BAPTA-AM劑量依賴性降低受損細(xì)胞［Ca2+］i，濃度為 10－6mol·L－1時(shí)使受損細(xì)胞［Ca2+］i降低至正常細(xì)胞水平。(2)本文工作進(jìn)一步證明BAPTA-AM可有效保護(hù)HepG-2細(xì)胞，減輕H2O2攻擊所致的細(xì)胞活力下降，其機(jī)制包括:減少細(xì)胞ROS生成;減少M(fèi)T損傷，維持膜電位;抑制CytC釋放而抑制MT凋亡通路的激活;抑制Caspase-9激活。Caspase-9是MT凋亡通路起始物，其活性抑制表明該通路受到抑制。(3)我們有資料(另文發(fā)表)表明BAPTA-AM也明顯抑制Caspase-8的激活，提示該藥也能抑制凋亡的死亡受體通路。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持BAPTA-AM作用的高效性:靜脈注射 BAPTA-AM 1-2.5 mg·kg－1，使 D-氨基半乳糖與內(nèi)毒素(LPS)所致的極性肝衰竭小鼠死亡率大大降低。以上結(jié)果相互支持。文獻(xiàn)報(bào)道［11］BAPTA-AM能抑制H2O2誘導(dǎo)的家兔腎近端小管細(xì)胞的死亡，減輕肺主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷，抑制Caspase-12和JNK的活化，逆轉(zhuǎn)Cardiotoxin-Ⅲ的細(xì)胞毒性，使因大腦中動(dòng)脈閉塞引起的腦梗死體積減小50.5%，均與本課題組工作一致。BAPTAAM對其它重要信號通路如TNF-α、Bcl蛋白、NF-κb也可能產(chǎn)生影響，我們將作進(jìn)一步觀察。就已有的結(jié)果看，BAPTA-AM作為抗細(xì)胞死亡、搶救瀕危細(xì)胞藥物，有良好的進(jìn)一步研發(fā)前景。

［1］Szydlowska K，Tymianski M.Calcium，ischemia and excitotoxicity［J］.Cell Calcium，2010，47(2):122－9.

［2］Rasheva V I，Domingos P M .Cellular responses to endoplasmic reticulum stress and apoptosis［J］.Apoptosis，2009，14(8):996 －1007.

［3］Roy S S，Hajnóczky G.Calcium，mitochondria and apoptosis studied by fluorescence measurements［J］.Method，2008，46(3):213－23.

［4］Talukder M A，Zweier J L，Periasamy M.Targeting calcium transport in ischaemic heart disease［J］.Cardiovasc Res，2009，84(3):345－52.

［5］Spigelman I，Tymianski M，Wallace C M，et al.Modulation of hippocampal synaptic transmission by low concentrations of cell permeant calcium chelators:effects of calcium affinity，structure and binding kinetics［J］.J Neurosci，1996，75(2):559 － 72.

［6］Cai L，Wang H，Li Q，et al.Salidroside inhibits H2O2-induced apoptosis in PC12 cells by preventing cytochrome c release and inactivating of caspase cascade［J］.Acta Biochim Biophys Sin，2008，40(9):796－802.

［7］匡 榮，孫意國，鄧同樂，等.松果菊苷對過氧化氫損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(4):515 －8.

［7］Kuang R，Sun Y G，Deng T L，et al.The protective effect and mechanisms of echinacoside on H2O2-injured PC12 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(4):515 －8.

［8］Zhou Y J，Zhang S P，Liu C W，et al.The protection of selenium on ROS mediated-apoptosis by mitochondria dysfunction in cadmium-induced LLC-PK1 cells［J］.Toxicol in Vitro，2009，23(2):288－94.

［9］Kinnally K W，Antonsson B.A tale of two mitochondrial channels，MAC and PTP，in apoptosis［J］.Apoptosis，2007，12(5):857－68.

［10］Shen H M，Liu Z G.JNK signaling pathway is a key modulator in cell death mediated by reactive oxygen and nitrogen species［J］.Free Rad Biol Med，2006，40(6):928－39.

［11］宋必衛(wèi)，儲(chǔ)昭興.BAPTA-AM的研究現(xiàn)狀［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(7):851 －3

［11］Song B W，Chu Z X.The research progress of BAPTA-AM［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(7):851 －3.

［12］蔡 雁，付再林，顧喜燕，等.BAPTA-AM抗D-GalN致L-O2細(xì)胞損傷作用［J］.浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，38(3):326－31.

［12］Cai Y，F(xiàn)u Z L，Gu X Y，et al.Protective effects and mechanism of BAPTA-AM on D-galactosmine-induced injury of L-O2 cells［J］.J Zhejiang Univ Technol，2010，38(3):326 －31.