陳 燕,郭寶鋒,邵 晨,楊寶學(xué),4,趙雪儉*

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院腎病科,吉林長春130021;2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室;3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院急診科;4.北京大學(xué)藥理學(xué)教研室)

多囊腎臟組織特異性敲除小鼠(pkd1flox/-;Ksp-Cre Mouse,以下簡稱為PKD小鼠)只在腎臟發(fā)生囊泡,而其他組織器官未見異常。為探討PKD小鼠腎功能在出生后隨天數(shù)增加的變化情況,本研究室培育PKD小鼠,分別檢測各時間點(diǎn)PKD小鼠及野生小鼠腎臟臟器系數(shù),并應(yīng)用尿素檢測試劑盒對各時間點(diǎn)小鼠腎臟組織、血清中尿素含量進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1動物PKD小鼠由美國加州大學(xué)舊金山醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)系引進(jìn),在本中心穩(wěn)定繁殖、傳代,經(jīng)基因組DNA鑒定確定小鼠的基因表型。

1.2腎臟組織的形態(tài)學(xué)檢查取新鮮腎臟組織用10%福爾馬林固定,石蠟包埋,切取4 μ m厚切片,常規(guī)脫蠟、脫水,HE染色,光鏡下觀察腎臟的病理改變并進(jìn)行拍照。

1.3腎臟組織的臟器系數(shù)將各實(shí)驗(yàn)組小鼠稱重,然后解剖小鼠取腎臟組織進(jìn)行稱重,計(jì)算公式:腎臟臟器系數(shù)=腎臟重量/小鼠體重。

1.4腎臟組織、血清中尿素含量的檢測取腎臟組織進(jìn)行組織勻漿后(1 mg/15 μ l),3 000 rpm離心,取上清,用尿素檢測試劑盒(Bioassay公司)對腎臟組織中尿素含量進(jìn)行檢測,檢測方法如下:取2.5 μ l腎臟組織上清樣本和標(biāo)準(zhǔn)品、2.5 μ l血清樣本和標(biāo)準(zhǔn)品分別加到清潔的96孔板中,然后分別加入100 μ l試劑A和試劑B,充分混勻,室溫孵育20 min后,用酶標(biāo)儀檢測(520 nm)。計(jì)算公式:尿素含量(mg/dL)=(樣品吸光度-空白吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)吸光度-空白吸光度)×稀釋倍數(shù)×50。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用平均值(s)標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示,進(jìn)行兩組比較時,采用 t檢驗(yàn),P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1多囊腎小鼠形態(tài)學(xué)改變

2.1.1病理改變 多囊腎小鼠早期腎臟大小正常,后期則增大,約為正常的10倍左右,并出現(xiàn)形態(tài)異常,如腎盂腎盞的變形,腎乳頭及腎錐體的完整結(jié)構(gòu)受到破壞等。一側(cè)腎臟可比另一側(cè)大,同側(cè)腎的囊腫大小發(fā)展也不一致,切面可見梭狀或柱狀囊腫,呈放射狀分布,囊腫呈球形,大小不一。初起時腎內(nèi)可僅有少數(shù)囊腫,隨病程進(jìn)展而漸增多,最終腎均被囊腫所占,從皮質(zhì)到髓質(zhì)充滿大小不等圓形囊腫,囊內(nèi)均含液體。腎盂和腎盞被膨脹的腎實(shí)質(zhì)壓迫而變窄、變小。在光鏡下,囊腫間尚可見到完整腎結(jié)構(gòu),從正常形態(tài)到出現(xiàn)腎小球硬化,小管萎縮、間質(zhì)纖維化等不同表現(xiàn),這些改變均為囊腫壓迫所致腎缺血所為(見圖1)。

2.1.2腎臟組織臟器系數(shù)的改變 出生后第1、3、6、9、12天,PKD組小鼠腎臟臟器系數(shù)與WT組小鼠相比,差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外,隨著出生后時間延長PKD組腎臟臟器系數(shù)逐漸升高,WT組隨時間變化不明顯(見圖2)。

2.2多囊腎小鼠腎臟組織中尿素含量變化

出生后第1、3、6、9、12天,PKD 組小鼠腎臟組織中尿素含量與WT組小鼠相比,差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外,隨著出生后時間延長PKD組腎臟組織中尿素含量逐漸升高,WT組略升高(見圖3)。

圖1 出生后不同時間點(diǎn)各組腎臟病理改變(上為WT,下為 PKD)400×

2.3多囊腎小鼠血清中尿素含量

出生后第1、3、6、9、12天,PKD 組小鼠血清中尿素含量與WT小鼠相比,顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PKD組小鼠血清中尿素含量隨出生后天數(shù)增加略有升高,而WT組小鼠血清中尿素含量隨時間變化不明顯(見圖4)。

圖2 出生后不同時間點(diǎn)各組小鼠腎臟器系數(shù)

圖3 出生后不同時間點(diǎn)各組小鼠腎臟組織尿素含量

圖4 出生后不同時間點(diǎn)各組 小鼠血清中尿素含量

3 討論

多囊腎(polycystic kidney disease)為遺傳性疾病,是腎臟一種先天性異常。雙側(cè)腎臟皮髓質(zhì)均可累及,但在程度上可不同。在遺傳方式上表現(xiàn)為常染色體顯性(ADPKD)和常染色體隱性遺傳(ARPKD)兩種。90%ADPKD患者的異?；蛭挥?6號染色體的短臂,稱為ADPKD1基因,另有10%不到患者的異?；蛭挥?號染色體的短臂,稱為ADPKD2基因[1,2]。常染色體顯性遺傳性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney,ADPKD)是一種常見的遺傳性腎病,發(fā)病率約為1/400-1/1 000,約占終末期腎衰病因的10%。ADPKD的主要特征是雙側(cè)腎臟形成多個液性囊泡,囊腫進(jìn)行性長大,造成腎臟結(jié)構(gòu)和功能的損害,最終可引起終末期腎衰。多囊腎病除影響腎臟外,還累及全身多個器官,如顱內(nèi)動脈瘤、二尖瓣脫垂、肝、胰、脾囊腫、腹壁疝及結(jié)腸憩室等,因此,ADPKD也是一種系統(tǒng)性疾病[3-5]。

尿素是蛋白質(zhì)及氨基酸分解代謝的主要最終產(chǎn)物,也是氨在肝臟中進(jìn)行解毒的產(chǎn)物,正常人血漿中尿素的濃度約為3.2-7.0 mmol/L,而每日尿中排除的尿素約有10-30克,食入蛋白質(zhì)越多,尿中排出尿素越多,因此排泄尿素是腎臟的主要功能之一。

多囊腎臟組織特異性敲除小鼠是特異性誘導(dǎo)腎臟PKD1基因發(fā)生突變而導(dǎo)致多囊腎發(fā)生的動物模型,因此只在腎臟發(fā)生囊泡,而其他組織器官不發(fā)生囊性變[6]。在國外先進(jìn)實(shí)驗(yàn)室條件下可以存活三周左右,在本試驗(yàn)室可存活兩周左右。本實(shí)驗(yàn)選取出生后第1、3、6、9、12天五個時間點(diǎn)將PKD 小鼠及野生小鼠處死,分別檢測各時間點(diǎn)PKD小鼠及野生小鼠腎臟臟器系數(shù),并應(yīng)用尿素檢測試劑盒對各時間點(diǎn)小鼠腎臟組織、血清中尿素含量進(jìn)行檢測。結(jié)果如上,可以看出PKD小鼠腎臟組織臟器系數(shù)在各時間點(diǎn)均明顯高于野生組,P＜0.05;PKD小鼠腎臟組織及血清中尿素含量在各時間點(diǎn)明顯高于WT組,P＜0.05;并隨出生時間延長逐漸升高;隨出生時間延長,小鼠一般狀態(tài)越來差,直至死亡。由此可見隨多囊腎小鼠出生時間延長、囊泡逐漸增多,腎功能進(jìn)行性惡化并出現(xiàn)明顯腎衰竭臨床癥狀,如進(jìn)食少,活動量下降等。這和臨床觀察常人染色體顯性遺傳多囊腎患者病程進(jìn)展一致。這提示我們對多囊腎的治療越早干預(yù),病人長生存率越高,如果能從基因水平加以干預(yù),該病有望得到治愈。

[1]Catherine Boucher and Richard Sandford.Autosomal dominant polycystic kidney disease(ADPKD,MIM 173900,PKD1 and PKD2 genes,proteinproducts known as polycystin-1 and polycystin-2)[J].European Journal of Human Genetics,2004,12:347.

[2]Tamio Yamaguchi,Scott J Hempson,Gail A.Reif,et al.Calcium Restores a Normal Proliferation Phenotype in Human Polycystic Kidney Disease Epithelial Cells[J].Journal of the American Society of Nephrology,2006,17:178.

[3]梅長林,李 林.常染色體顯性遺傳性多囊腎病分子遺傳、發(fā)病機(jī)制及治療進(jìn)展[J].腎臟病與透析腎移植雜志,2001,10(5):454.

[4]Sayu Omori,Mariko Hida,Hisayo Fujita,et al.Extracellular Signal-Regulated Kinase Inhibition Slows Disease Progression in Mice with Polycystic Kidney Disease[J].Journal of the AmericanSociety of Nephrology,2006,17:1604.

[5]P Hughes,M Robati,W Lu,et al.Loss of PKD1 and loss of Bcl-2 elicit polycystic kidney disease through distinct mechanisms[J].Cell Death and Differentiation,2006,13:1123.

[6]Baoxue Y,ND Sonawane,Dan Z,et al.Small Molecule CFTR Inhibitors Slow Cyst Growth inPKD[J].Journal of the American Society of Nephrology,2008,1:1.