川木通與其混偽品和近緣種的ITS2條形碼分子鑒定

劉美子 李美妮 姚輝 劉萍

川木通為較常用中藥，主產(chǎn)于四川等地，具有清熱利尿，通經(jīng)下乳等功效。2010版《中國藥典》收載的川木通為毛茛科植物小木通(ClematisarmandiiFranch.)或繡球藤(ClematismontanaBuch.-Ham.)的干燥藤莖[1]。由于本草中記載的異物同名，同物異名和地方用習(xí)用品等原因，商品川木通的品種混亂情況較為嚴重[2]，包括毛茛科鐵線蓮屬、木通科木通屬(如木通)、馬兜鈴科馬兜鈴屬(如關(guān)木通)等多種植物的藤莖，其中木通與川木通在有效成分、藥理作用和主治功能上雖有相似之處[3]，但功效各有側(cè)重，應(yīng)區(qū)別使用。關(guān)木通由于腎毒性而被禁用后，川木通的需求量日益增大 ，而藥典收載的繡球藤生長海拔較高，市場上流通的川木通實際上?；煊心就ɑ蜩F線蓮屬的多種植物的藤莖[4]。川木通與木通為不同科屬的植物，依靠外觀形態(tài)或顯微鑒定可明顯區(qū)分，但與同屬混偽品和近緣種則需要尋找一種快速、準(zhǔn)確的分子鑒定方法，以確保臨床的安全用藥，近年發(fā)展起來的DNA條形碼技術(shù)在近緣種鑒定方面顯示出了明顯的優(yōu)勢。

DNA條形碼技術(shù)是隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展而出現(xiàn)的物種鑒定新技術(shù)。它是利用一段短的標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列作為標(biāo)記而建立的物種鑒定方法，目前已被廣泛應(yīng)用于藥用植物鑒定[5-8]。nrITS序列常用于不同分類階元的系統(tǒng)進化研究，尤其是屬水平或?qū)傧滤降难芯縖9]，nrITS由ITS1、5.8S、ITS2三部分構(gòu)成，Chase等[10]研究表明，ITS2序列與ITS序列的物種鑒定效率相當(dāng)，但其序列長度只有ITS的1/3，因此具有較高的擴增效率，ITS2已成為熱點的條形碼候選序列[11-13]。本文應(yīng)用ITS2序列對川木通及其混偽品和近緣種進行分析，為近緣物種的分子鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

川木通基原植物繡球藤及其混偽品木通、三葉木通、棉團鐵線蓮的的新鮮葉片分別采自四川汶川、成都、南充，廣西南寧和北京，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖副研究員進行鑒定，硅膠干燥保存，材料信息詳見表1。此外，從GenBank下載了川木通與其混偽品和近緣種的ITS2序列，詳見表2。

表1 材料采樣信息

1.2 方法

采用植物DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取DNA。ITS2序列的PCR擴增及測定方法均參考Chen等研究[14]，將實驗樣本的雙向測序峰圖用CodonCode Aligner V3.7.1校對拼接，并剪切引物區(qū)。對拼接后得到的序列和GenBank下載的ITS2序列用HMMer注釋法切除5.8S和26S端，保留ITS2的全長。用MEGA5軟件對川木通種內(nèi)、種間序列進行分析，采用Koetschan等[15]建立的ITS2數(shù)據(jù)庫預(yù)測ITS2二級結(jié)構(gòu)，應(yīng)用BLAST方法對川木通及其同屬混偽品和近緣種進行鑒定分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 川木通基原植物的ITS2序列長度，GC含量及種內(nèi)變異

小木通ITS2序列長度為218～220 bp，平均GC含量為68.9%，含5～6個POLY結(jié)構(gòu)(≥5個單堿基重復(fù))，為4～5個PolyC和1個PolyG結(jié)構(gòu)。小木通2條序列比對后長度為220 bp，主要變異位點有四處，為74、133位點處的T-C單堿基轉(zhuǎn)換，127位點處的TT-CC雙堿基轉(zhuǎn)換和122位點處的C-T單堿基轉(zhuǎn)換，種內(nèi)K2P距離為0.0285。

繡球藤ITS2序列長度為218 bp，平均GC含量為66.5%，含5個POLY結(jié)構(gòu)，為4個PolyC和1個PolyG。繡球藤3條序列比對后長度為218 bp，主要變異有四處，為23位點處的A-T變異，122位點處的T-C變異，179位點處的ATC-TAA三位點變異，193位點處的A-G變異，種內(nèi)平均K2P距離為0.0187，種內(nèi)最大K2P距離為0.0280。

2.2 川木通及其主要混偽品的鑒定

2.2.1 種間變異

川木通與主要同屬混偽品女萎(Clematisapiifolia)、短尾鐵線蓮(Clematisbrevicaudata)的種間平均距離為0.0339，種間最小距離為0.0046， 種間變異較小。 川木通與木通科木通的三個基原木通[Akebiaquinata(Thunb.) Decne.]、三葉木通[Akebiatrifoliata(Thunb.) Koidz.]或白木通[Akebiatrifoliata(Thunb.) Koidz. var. Australis (Diels) Rehd.]的種間平均K2P距離為0.5398，種間最小K2P距離為0.5257，變異位點有94處，種間變異較大；川木通與馬兜鈴科關(guān)木通(AristolochiamanshuriensisKomarov)的種間平均K2P距離為0.6155，種間最小K2P距離為0.5801，變異位點有109處，種間變異較大。川木通與其主要混偽品ITS2序列的種間比對見圖1。

2.2.2 ITS2序列二級結(jié)構(gòu)分析

如圖2所示，川木通基原植物小木通與繡球藤在螺旋(Helix)IV區(qū)有差異，川木通與其同屬主要混偽品女萎和短尾鐵線蓮的差異也在螺旋IV區(qū)，而與混偽品木通、三葉木通、白木通在螺旋I、II、III和IV區(qū)均存在明顯差異。

2.3 川木通與其同屬近緣種的鑒定

運用BLAST方法(Chen et al，2010)計算鐵線蓮屬的鑒定效率，結(jié)果表明川木通的基原植物小木通和繡球藤均能與同屬的31種易混偽品被正確鑒定，而易混品種之間除芹葉鐵線蓮(C.aethusifolia)與須蕊鐵線蓮(C.pogonandra)，銹毛鐵線蓮(C.leschenaultiana)與錫金鐵線蓮(C.siamensis)，甘青鐵線蓮(C.tangutica)與中印鐵線蓮(C.tibetana)互相不能鑒定外，其他同屬近緣物種均能區(qū)分開，ITS2條形碼對鐵線蓮屬的鑒定成功率達到87%。

3 討論

川木通的商品藥材來源于野生資源，由于生態(tài)環(huán)境惡化，造成川木通資源短缺[16]，于是多種鐵線蓮屬植物的藤莖摻入川木通藥材中[4]。大部分文獻報道的均是川木通與性狀差別較大的木通的鑒定[2，17]，而對于親緣關(guān)系較近的同屬混偽品，用傳統(tǒng)分類方法很難區(qū)分，針對此問題，基于ITS2條形碼的分子鑒定方法顯示出其優(yōu)勢。ITS2作為條形碼不僅具備ITS序列變異率高、進化快的特點，還具有保守的5.8S和26S便于設(shè)計通用引物，約200～300 bp的長度便于擴增和測序，可以用于部分降解的中藥材的鑒定[18]。通過對川木通及其混偽品和近緣物種的分析，川木通基原植物繡球藤和小木通與其混偽品木通和關(guān)木通ITS2序列具有顯著的種間變異，與同屬混偽品女萎和短尾鐵線蓮的種間變異小。川木通基原植物繡球藤和小木通與同屬混偽品女萎和短尾鐵線蓮的ITS2二級機構(gòu)在螺旋IV區(qū)有差異，用BLAST方法能夠?qū)⒋就ㄅc其同屬易混品和近緣物種區(qū)分開，對鐵線蓮屬的鑒定成功率達到87%，可見ITS2條形碼能夠用于親緣關(guān)系較近的正品與混偽品的鑒定。

ITS2序列作為DNA條形碼用于中藥鑒定具有準(zhǔn)確、快捷的優(yōu)勢，此外其二級結(jié)構(gòu)能夠為發(fā)現(xiàn)新物種和分類學(xué)研究提供更多的信息[19]，賦予ITS2更為強大的功能，為中藥混偽品和近緣物種分子鑒定開拓了新思路。

圖1 川木通與其主要混偽品木通、女萎、短尾鐵線蓮的種間變異

圖2 川木通、木通及其主要易混偽品的二級結(jié)構(gòu)比較

[1] 國家藥典委員會.中國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:34.

[2] 孔增科,李利軍,郭明,等.木通與川木通及關(guān)木通的鑒別與合理應(yīng)用[J].河北中醫(yī),2007,19(1):58-60.

[3] 何報作.三種被取消藥用標(biāo)準(zhǔn)的藥材同其替換品及易混淆品的鑒別[J].廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2005，8(1)：48-50.

[4] 唐遠,萬德光,裴瑾,等.川木通的研究進展[J].時珍國醫(yī)國藥,2007,18(10):2346-2347.

[5] Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA,et al. Use of DNA barcodes to identify flowering plants[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(23):8369-8374.

[6] Song JY, Yao H, Li Y,et al. Authentication of the family Polygonaceae in Chinese pharmacopoeia by DNA barcoding technique[J]. J Ethnopharmacol,2009,124(3):434-439.

[7] Gao T, Yao H, Song JY, et al. Identification of medicinal plants in the family Fabaceae using a potential DNA barcode ITS2[J]. J Ethnopharmacol, 2010, 130(1): 116-121.

[8] 陳士林,宋經(jīng)元,姚輝,等.藥用植物DNA條形碼鑒定策略及關(guān)鍵技術(shù)分析[J].中國天然藥物,2009,7(5):322-327.

[9] Alvarez I, Wendel JF. Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference[J]. Mol Phylogenet Evol. 2003, 29(3):417-314.

[10] Chase MW，Salamin N, Wilkinson M, et al. Land plants and DNA barcodes: short-term and long-term goals[J]. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2005, 360(1462):1889-1895.

[11] 羅焜，陳士林，陳科力，等.基于蕓香科的植物通用DNA條形碼研究[J]．中國科學(xué):生命科學(xué)，2010，30(4):342-351.

[12] 朱英杰，陳士林，宋經(jīng)元，等.重樓屬藥用植物DNA 條形碼鑒定研究[J].藥學(xué)學(xué)報,2010,45(3):376-382.

[13] Pang XH, Song JY, Chen SL,et al. Applying plant DNA barcodes for Rosaceae species identification[J]. Cladistics, 2011,27:165-170.

[14] Chen S, Yao H, Han JP,et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J]. PLoS ONE, 2010,5(1):e8613.

[15] Koetschan C, F?rster F, Keller A,et al. The ITS2 Database III-sequences and structures for phylogeny[J]. Nucleic Acids Res, 2010,38(Database issue):D275-D279.

[16] 李彬,陳幸方,清茂,等.川木通的品質(zhì)研究[J].四川中醫(yī),2009,27(6):58-59.

[17] 張斌慧,余梅,楊斌.木通、川木通與關(guān)木通的比較鑒別[J].貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2006,28(5):37-38.

[18] Chiou SJ, Yen JH, Fang CL,et al.Authentication of medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with specific primers[J].Planta Med, 2007,73(13):1421-1426.

[19] Prasad PK, Tandon V, Biswal DK,et al. Phylogenetic reconstruction using secondary structures and sequence motifs of ITS2 rDNA of Paragonimus westermani (Kerbert, 1878) Braun, 1899(Digenea: Paragonimidae)and related species[J]. BMC Genomics,2009,10(Suppl 3):S25.