何 浪,李國軍,劉光波,王 丹△

(1.成都醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系 610081;2.成都醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)本科2007級 610081;3.遼寧建筑職業(yè)技術(shù)學(xué)院,遼寧遼陽111000)

在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中,M TT比色法自1983年建立以來[1],已成為細(xì)胞生物學(xué)及相關(guān)研究領(lǐng)域的一種分析細(xì)胞活性、生長增殖和抗癌藥物篩選及臨床腫瘤藥敏試驗(yàn)的常用方法[2]。但該法需加入二甲基亞砜(DMSO)溶解甲臜顆粒,可能遇到顆粒不完全溶解以及在吸取上清液的操作中易帶走部分細(xì)胞等問題。利用 Cell counting kit-8(CCK-8)檢測細(xì)胞活性的方法(WST-8法)[3]。只需將CCK-8試劑按比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中,經(jīng)過一定時(shí)間孵育,活細(xì)胞即可將WST-8代謝為水溶性的甲臜染料,即可直接測定細(xì)胞活性[4]?，F(xiàn)將MT T、WST-8法檢測三羥異黃酮(genistein,GEN)對SW480細(xì)胞的生長抑制比較報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 結(jié)腸癌細(xì)胞SW480(成都醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存)。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、M TT,GEN?；罴?xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK-8、WST-8試劑(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2 試劑 GEN用DMSO溶解,實(shí)驗(yàn)時(shí)用RPM I1640培養(yǎng)液稀釋,終濃度分別為25、50、100、200 mol/L[5],DMSO 終濃度小于0.1%。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 選用對數(shù)生長期、臺盼藍(lán)拒染率大于95%的SW480細(xì)胞,用含10%胎牛血清的RPM I1640培養(yǎng)液培養(yǎng),含青霉素100 U/mL、鏈霉素100 g/mL,置 37 ℃、5%CO2溫箱中,2～3 d換液1次,當(dāng)細(xì)胞豐度超過 80%時(shí)傳代。

1.4 M TT、WST-8法檢測GEN對SW480細(xì)胞生長的抑制作用 將處于對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化,6×103/孔接種于96孔板中?？瞻讓φ占尤牒珼MSO的RPMI1640培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2。細(xì)胞貼壁,進(jìn)入指數(shù)生長期后,加入不同濃度 GEN 培養(yǎng)液(0、25、50、100、200 mol/L)200μL,每個(gè)濃度設(shè)8個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后分別用MTT、WST-8法測定各孔的光密度(optical density,OD)值(分別為A570、A450,以空白對照調(diào)零)。具體操作按試劑說明書進(jìn)行。以下公式計(jì)算出GEN對SW480細(xì)胞生長抑制率:

細(xì)胞生長抑制率=(1-藥物組OD值/細(xì)胞對照組OD值)×100%。

1.5 WST-8法孵育時(shí)間 細(xì)胞接種同上,給藥48 h后加20 μ L CCK-8溶液,細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育 0.5、1、2、4 h,分別測定各孔的OD值(A450,以空白對照調(diào)零)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。組間OD值比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD法。生長抑制率的比較采用配對計(jì)量資料的符號秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

兩種測定方法均表明,GEN作用48 h后SW480細(xì)胞的生長明顯受抑制,并且隨著GEN濃度的增加,這種抑制作用亦增強(qiáng)。這兩種測定方法所得GEN在25～200 mol/L各濃度時(shí)對SW480細(xì)胞的生長抑制率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。不同濃度GEN作用后的加入CCK-8試劑后孵育不同時(shí)間,隨孵育時(shí)間增加,OD值逐漸增加至4 h時(shí)已足夠用于測量,但在孵育1～2 h之間,OD值增幅較小,GEN濃度分別為 25、50、100、200 mol/L 時(shí),趨勢相同,故認(rèn)為對于SW480細(xì)胞,WST-8法測量 OD值的最佳時(shí)間為孵育1～2 h。1～2 h中,WST-8法OD值高于MT T法,短時(shí)間內(nèi)反映細(xì)胞增殖抑制狀況優(yōu)于M TT法,見表2。

表1 兩種方法測定GEN作用后抑制率比較

表2 兩種方法不同作用時(shí)間后OD值比較(±s)

表2 兩種方法不同作用時(shí)間后OD值比較(±s)

加MT T或CCK-8后繼續(xù)孵育時(shí)間 MT T法 WST-8法1 h 0.257±0.046 0.430±0.035 2 h 0.380±0.016 0.477±0.055

3 討 論

GEN是大豆中主要的異黃酮成分,已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長,成為一種很有潛力的生物抗腫瘤藥物,但其具體機(jī)制尚未完全清楚[6-9]。本研究表明,GEN能對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用,這種作用存在濃度依賴性。但是用兩種方法測定的細(xì)胞生長抑制率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,故認(rèn)為兩種方法均能準(zhǔn)確反映細(xì)胞的增殖抑制狀況。

CCK-8試劑中含有WST-8,其化學(xué)名稱為2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽。WST-8在電子載體1-Methoxy PMS的作用下能被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲臜物,生成的甲臜數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比,通過酶標(biāo)儀測量細(xì)胞液的A450,可檢測出待測細(xì)胞樣品的活性[3]。同時(shí),反應(yīng)所生成甲臜晶體數(shù)量與加入檢測試劑后繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間之間具有較大的相關(guān)性,且對不同種類的細(xì)胞在恰當(dāng)?shù)臋z測時(shí)機(jī)方面均存在細(xì)微的差別。本研究結(jié)果顯示,WST-8法短時(shí)間內(nèi)反映細(xì)胞增殖抑制狀況優(yōu)于M TT法。

綜上所述,M TT、WST-8法用于細(xì)胞活性計(jì)數(shù)最終結(jié)果相似,而WST-8法與M TT法相比操作相對簡便,短時(shí)間內(nèi)測定反映細(xì)胞增殖狀況優(yōu)于M TT法,應(yīng)用價(jià)值較大。WST-8法結(jié)果不僅客觀準(zhǔn)確,且大大減輕工作量和時(shí)間,具有一定的實(shí)用性和經(jīng)濟(jì)性。

[1] Mosman T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assays[J].J ImmunolMethods,1983,65(1/2):55-63.

[2] Cetin Y,Bullerman LB.Cytotoxicity of Fusarium mycotoxins to mammalian cell cultures as determined by the M TT bioassay[J].Food chemical Tocicology,2005,43(5):755-764.

[3] Tominaga H,Ishiyama M,Ohseto F,et al.A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay[J].Anal Commun,1999,36(2):47-50.

[4] 張誠,陳幸華,張曦,等,人臍血源基質(zhì)細(xì)胞對小鼠淋巴細(xì)胞增殖作用的研究[J].重慶醫(yī)學(xué),2008,37(21):2427-2429.

[5] 李晶,李忠,莫寶慶.三羥異黃酮對人乳腺癌細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶影響[J].中國公共衛(wèi)生,2006,22(5),546-547.

[6] Sarkar FH,Li Y.Soyisoflavones and cancer prevention[J].Cancer Invest,2003,21(5):744-757.

[7] Xingya W,Elizabeth AC,Joshua AB.Genistein modulates prostate epithelial cell proliferation via estrogen and extracellularsignal-regulated kinase-dependentpathways[J].J Nutri Biochem,2006,17(3):204.

[8] Ahmed ES,Michael CA.Regulation of HMG-CoA reductase in M CF-7 cells by genistein,EPA and DHA alone and in combination with mevastatin[J],Cancer,2005,224(2):221.

[9] Jennifer DB,Lilian UT.M ammalian lignans and genistein decrease the activities of aromatase and 17β-hydroxysteroid dehydrogenase in MCF-7 cells[J].J Steroid Biochem Mol Biol,2005,94(5):461.