HPLC法測(cè)定清化丸中黃芩苷含量*

孫燕燕，陳雙璐，錢(qián)宇坤

(天津市兒童醫(yī)院，天津 300074)

清化丸是《天津市醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》2008年收載的本院傳統(tǒng)成方制劑，由玄參、連翹、馬尾蓮、黃芩、蒲公英、苦地丁、天花粉、赤芍、黃柏等16味中藥組成的傳統(tǒng)蜜丸，有清熱解毒、軟堅(jiān)消腫的功效，用于急性淋巴腺炎，瘡癤化膿性皮膚病。該藥為醫(yī)院制劑，藥物成分復(fù)雜，近年來(lái)對(duì)其質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)報(bào)道較少，筆者查閱有關(guān)文獻(xiàn)[1-5]，采用HPLC法測(cè)定清化丸中黃芩苷含量，結(jié)果顯示該方法簡(jiǎn)便快捷、精密度高、重現(xiàn)性好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-2010A高效液相色譜儀(日本島津)；LC solution色譜工作站；雙頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 黃芩苷對(duì)照品(由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)110715-200212)；色譜分析用甲醇為色譜純，水為純凈水，其他試劑為化學(xué)純；清化丸(本院自制，批號(hào)20100301、20100501、20100701)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Shim-pack VP-ODS (150 mm×4.6 mm，5 μm )；流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸(40∶60∶1)；柱溫40 ℃；流速1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm：進(jìn)樣量5 μl。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 500。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的黃芩苷對(duì)照品適量，加70%乙醇制成每1 ml含50 μg的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 取本品適量，剪碎，取1 g，精密稱定，精密加入70%乙醇50 ml，稱定重量，超聲處理(功率240 W，頻率45 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.2.3陰性樣品溶液的制備 按處方配比，取除黃芩外的其他各藥味，按清化丸的制備方法制得樣品，再按“2.2.2”供試品溶液制備方法，制得陰性樣品溶液。

2.2.4專屬性試驗(yàn) 分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果表明，供試品溶液在對(duì)照品溶液黃芩苷峰保留時(shí)間處有一色譜峰，而陰性對(duì)照溶液在該處未出現(xiàn)色譜峰，對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算均大于2 500；分離度符合要求。HPLC圖譜見(jiàn)圖1。

1.黃芩苷

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取105 ℃干燥至恒重的黃芩苷對(duì)照品5.40 mg，加70%乙醇適量，超聲處理30 min，放冷，分別制成濃度為0.021 6、0.043 2、0.064 8、0.086 4、0.108 0、0.129 6 mg/ml的對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定各自峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)，求得回歸方程：Y=3 014 105.38X-9 115.21(r=0.999 8)。結(jié)果表明黃芩苷在0.108～0.648 μg范圍內(nèi)線性良好。

2.4精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定黃芩苷峰面積，峰面積平均值為1 292 607.5，RSD為0.69%，符合要求。

2.5重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品1 g，精密稱定，共6份，分別按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析測(cè)定。結(jié)果樣品中黃芩苷平均含量為3.499 mg/g，RSD為0.22%(n=6)，符合要求。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品1 g，精密稱定，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，分別在0、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)得各時(shí)間點(diǎn)樣品峰面積值的RSD為0.95%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7加樣回收試驗(yàn) 取同一批號(hào)(20100301)樣品適量，剪碎，取0.5 g，共6份，精密稱定，分別精密加入黃芩苷對(duì)照品溶液(0.034 16 mg/ml)50 ml，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，制得供回收率用供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為101.5%，RSD為1.30%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 黃芩苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.8樣品含量測(cè)定 取3批清化丸樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品中黃芩苷含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1溶劑的選擇 取同一批號(hào)(20100301)樣品，剪碎，取1 g，精密稱定，分別精密加入50%乙醇、70%乙醇各50 ml，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，稱定重量，用各自溶劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，測(cè)定樣品中黃芩苷的含量。結(jié)果采用70%乙醇溶劑和50%乙醇溶劑提取樣品中黃芩苷含量分別為3.499和3.231 mg/g，故采用70%乙醇為提取溶劑。

3.2提取方式的確定 取同一批號(hào)(20100301)樣品，剪碎，取1 g，精密稱定，分別精密加入70%乙醇50 ml，稱定重量，分別超聲處理(功率240 W，頻率45 kHz)和加熱回流方式，提取時(shí)間均為30 min，放冷，稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足各自減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，測(cè)定樣品中黃芩苷的含量。結(jié)果采用超聲提取和加熱回流樣品中黃芩苷含量分別為3.499和3.189 mg/g，故采用超聲處理方式提取。

3.3提取時(shí)間的考查 取同一批號(hào)(20100301)樣品，剪碎，取1 g，精密稱定，分別精密加入70%乙醇50 ml，稱定重量，分別采用超聲處理20、30、45 min，放冷，稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足各自減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，測(cè)定樣品中黃芩苷的含量。結(jié)果超生處理20、30和45 min后樣品中黃芩苷含量分別為3.204、3.499和3.513 mg/g，認(rèn)為提取30 min即可將樣品中的黃芩苷提取完全，故提取時(shí)間定為30 min。

3.4本實(shí)驗(yàn)采用的高效液相色譜法準(zhǔn)確性高、簡(jiǎn)便可靠、重復(fù)性好，排除了其他組分對(duì)測(cè)定的干擾，可用于清化丸中黃芩苷含量的測(cè)定。

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