納米二氧化硅顆粒免疫凝聚用于霍亂毒素的檢測研究

余紅偉，王源升,2*，李 瑜，蔣健暉,吳海龍,魏 徴，沈國勵，俞汝勤

（1.海軍工程大學理學院化學與材料系，湖北武漢430033）

（2.四川大學高分子材料科學工程國家重點實驗室，四川成都610065）（3.湖南大學化學生物傳感與計量學國家重點實驗室，湖南長沙410082）

0 引言

膠乳凝集試驗方法（LAT）是將抗體結合到膠乳微粒（直徑約1.0 μm）表面，通過抗體識別相應抗原的特異性凝集反應，實現(xiàn)了對目標抗原的靈敏檢測[1]，LAT具有簡單、輕便、快速、選擇性高等優(yōu)點。1990年，Kurosawa等[2]首次將膠乳凝集法應用于壓電傳感檢測領域，提出了一種膠乳型壓電免疫檢測方法（LPEIA），利用壓電晶體對膠乳免疫凝集反應引起溶液密度、粘度等非質量參數(shù)變化的靈敏響應進行檢測。其后，人們利用這種非質量效應型壓電傳感分析模式檢測了多種生化物質[3～7]。近年來，人們采用納米或亞微米級顆粒取代傳統(tǒng)微米級膠乳進行凝集試驗的研究發(fā)展很快[7～9]。相對傳統(tǒng)LAT而言，基于納米或亞微米級顆粒的免疫凝集試驗具有許多優(yōu)點：顆粒的懸浮穩(wěn)定性高、背景響應信號低、易于獲得較低檢測下限等[7～9]。特別是SiO2顆粒作為親水型材料，比普通膠乳具有更高的密度、比表面積和物理化學穩(wěn)定性，同時易于制備和進行功能化處理，從而用作生物活性物質的載體（標記體）進行生化檢測具有許多優(yōu)勢。

李瑜等進行了一系列基于壓電LAT技術結合SiO2納米顆粒對目標物的檢測研究[10～14]，該文以SiO2納米顆粒替代傳統(tǒng)膠乳微粒標記霍亂毒素抗體，根據(jù)壓電免疫凝集傳感原理建立了一種改進的LPEIA技術用于霍亂毒素的直接、快速的檢測。實驗中，將修飾好的探針浸入磷酸鹽緩沖液中，接著加入霍亂毒素抗體標記的SiO2納米顆粒。反應體系中SiO2納米顆粒表面的霍亂毒素抗體與霍亂毒素發(fā)生免疫凝集反應，使得溶液的粘度發(fā)生變化。該實驗先在晶振表面固定霍亂毒素抗體，再用BSA封閉金電極表面未結合抗體的位點，以有效地減少非特異性吸附，而且探針上修飾的抗體可以結合抗原-SiO2-抗體復合物。因此，該傳感器的信號通過兩個因素獲得有效放大：一是溶液性質的變化包括密度和粘度；二是吸附在晶振表面的物質的質量變化。將壓電檢測的質量效應和溶液粘彈性的變化有效結合，很好的起到信號放大作用，實現(xiàn)了對目標物的直接、快速、靈敏的檢測。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

正硅酸乙酯（TEOS）和曲拉通X-100（廣東省汕頭市西隴化工廠）；霍亂毒素 （Cholera Toxin from Vibrio cholerae）及其抗體 （Anti-Cholera Toxin antibody produced in rabbit）、3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTES）（Sigma-Aldrich 公司）；氨水（30%）、丙酮、乙醇、聚乙二醇（PEG，MW 6.0 kD）（天津天泰精細化工公司）；戊二醛（GLU）（Fluka試劑公司）；血清白蛋白（BSA）（北京鼎國生物制品有限公司）。

9 MHz、AT-切型雙面鍍金石英晶振(QCM)（北京晨星無線電設備廠）；壓電分析儀(QCA922)（美國普林斯頓應用研究所）；磁力攪拌器(Model JB-2)（上海分析儀器廠）；CSS501型恒溫箱（重慶實驗裝備廠）；TCL-16A型臺式高速冷凍離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）；透射電子顯微鏡(TEM，HITACHI-H800)（日本 HITACHI公司）；銅柵(No.50-230)（中國科學研究院北京科學儀器公司）；B220S-T型超聲清洗器（上海必能信超聲有限公司）。

1.2 實驗過程

1.2.1 納米二氧化硅顆粒的制備及標記

按文獻[13]報道的通過氨水催化正硅酸乙酯（TEOS）水解制備SiO2顆粒，在此實驗中所用到的玻璃器皿均先用王水浸泡再用超純水清洗。壓電免疫凝集過程通過將石英晶片浸于含緩沖溶液（PBS，pH7.4）的自制的反應池來測定。

具體流程如下：

制備二氧化硅顆粒：

①將15mL曲拉通X-100、60mL環(huán)己烷、15mL正己醇依次加入到250mL的三頸燒瓶中于室溫下（25℃）劇烈攪拌反應15 min，攪拌器轉速為400 r/min（下文中攪拌器均為此轉速）。②加入4mL去離子水到三頸燒瓶中，室溫下攪拌15 min。③加入2mL氨水（30%）到三頸燒瓶中，室溫下攪拌15 min。④加入2mL正硅酸乙酯（TEOS）到三頸燒瓶中，于室溫下攪拌24 h。⑤將制得的SiO2納米顆粒懸混于丙酮進行離心分離，再采用乙醇和水進行超聲洗滌和分離，以除去“油”和表面活性劑分子。透射電鏡分析結果表明這樣制出的SiO2納米顆粒的粒徑大約為50 nm（見圖1）。

二氧化硅顆粒的氨基硅烷化及抗體標記：

①取一定量 (30 mg)SiO2顆粒懸混于10mL甲醇中，加入0.30mL APTES，超聲分散15 min后，再于室溫下攪拌反應12 h，離心分離；然后依次采用甲醇和PBS溶液(pH7.0)進行超聲洗滌，再離心分離，即完成SiO2顆粒的氨基硅烷化。②取10mL氨基硅烷化的SiO2顆粒懸濁液，先超聲分散15 min，再加入5.0mL 2.5%戊二醛，于室溫下攪拌反應3 h，再離心分離，即完成顆粒的醛基化。③將醛基化的SiO2顆粒懸混于4.0mL PBS溶液，超聲分散15 min后，加入1.0mL霍亂毒素抗體原液，于37℃下溫育1 h，離心分離，即制得霍亂毒素抗體-SiO2顆粒。然后，將顆粒懸混于4.0mL PBS溶液中，加入1mL濃度為10 mg/mL的BSA，于室溫下攪拌反應1.5 h，以封閉霍亂毒素抗體-SiO2顆粒表面非特異性結合 （醛基）位點，離心分離，最后以PBS溶液超聲洗滌，并懸混于3.0mL PBS溶液，直接用于分析或于4℃下保存（一般可穩(wěn)定2個月）。

圖1 納米二氧化硅的透射電鏡圖：(a)凝聚后的硅顆粒；(b)氨基硅烷化的硅顆粒Fig.1 TEM figures of silica nanoparticles:(a)agglutinated silica nanoparticles；(b)amine-derivatized silica nanoparticles

1.2.2 傳感器金電極修飾

滴加30 μL滴度為900的霍亂毒素抗體溶液到洗凈的壓電探針表面，晶振的一面用O型橡膠圈和塑料片封閉，使之單面觸液于37℃恒溫槽中溫育1 h后用去離子水將晶振表面洗凈晾干，加30 μL濃度為10 mg/mL BSA溶液到壓電探針表面，在37℃恒溫槽下溫育1 h以封閉其表面蛋白吸附位點，再以PBS溶液（pH7.4）洗滌后，晾干備用。

1.2.3 凝聚檢測

將修飾好的壓電傳感探針安裝于盛有一定體 積 的 PBS 溶 液 （pH6.7，1.5 mg/mL PEG，40 mmol/L NaCl）的檢測池中。在緩慢攪拌下向反應池中注入一定量的霍亂毒素抗體-SiO2懸濁液，檢測池中溶液的總體積為200 μL。待探針的響應頻率達到穩(wěn)定后，再加入不同濃度的霍亂毒素到反應池中。在免疫反應進行期間，頻率響應數(shù)據(jù)均被記錄，直到響應達到平衡。對壓電石英晶振的響應性能的考察主要包括以下方面：探針表面修飾，分析介質的組成以及相應的控制實驗。所有實驗數(shù)據(jù)都重復三次以上，實驗溫度控制在25℃。

2 結果與討論

在凝聚反應體系中，隨著免疫反應的進行，免疫凝集物逐漸在溶液中形成。這些免疫凝集物不僅能改變吸附在晶振表面的質量負載，而且能同時改變體系溶液的密度及粘度。為了得到理想的頻率響應，晶振表面必須通過修飾來消除非特異性吸附。非特異性吸附一般是由于血清成分與傳感器表面之間的靜電作用引起的[15]。Chen等[14]考察了多種界面修飾方案來降低由非特異性吸附而造成的背景干擾。晉曉勇等[12]也考察了不同的界面修飾對免疫凝聚的影響。研究結果表明，晶振表面用抗體和BSA封閉后可以有效地抑制探針表面的非特異性吸附。因此在該實驗中，先在晶振表面修飾霍亂毒素抗體，再用BSA進行封閉。這樣處理后，BSA作為封閉劑可以有效地降低非特異性吸附；霍亂毒素抗體修飾的傳感界面可以特異性結合抗原-SiO2-抗體復合物，從而引起顯著的頻率響應。

2.1 分析介質優(yōu)化

分析介質的優(yōu)化對于提高免疫凝集分析的靈敏度和消除血清成分非特異性吸附非常重要。在該實驗中，免疫凝集分析介質包括以下幾個主要因素：pH值對凝集反應的影響；NaCl濃度對凝聚反應的影響；抗體標記的納米二氧化硅顆粒的合適用量；一定量的PEG作為免疫凝集反應的促進劑。

由于免疫凝集過程與膠體的帶電量及其性質密切相關，因而受環(huán)境pH條件的影響較大。圖2(a)顯示了溶液pH值對特異性凝集反應的影響。從圖中可看出，在pH7.0溶液中，免疫凝集反應的響應頻率達到峰值。表明中性條件有利于霍亂毒素抗體-SiO2顆粒免疫識別相應抗體，這可能因為中性pH值條件下，霍亂毒素抗體-SiO2顆粒間以及抗體與抗原間靜電排斥力較小，從而有利于顆粒發(fā)生免疫凝集反應而且利于反應主體間保持凝集所需的合適庫侖作用力[17]。因此，實驗選擇在pH7.0的PBS溶液中進行免疫凝集檢測。

圖2 分析介質的優(yōu)化(a)不同pH值下晶振對2.5 μg/mL霍亂毒素的頻率響應；(b)不同鹽離子(NaCl)濃度下晶振對2.5 μg/mL霍亂毒素的頻率響應，溶液的pH值為7.0；(c)壓電探針表面檢測池中抗體標記納米二氧化硅的用量對霍亂毒素的頻率響應；(d)PEG對凝聚反應的影響：Ⅰ為未使用PEG時壓電探針對2.5 μg/mL霍亂毒素的實時頻率響應，Ⅱ為使用PEG后壓電探針的實時頻率響應Fig.2 Optimization of the assay medium,the concentration of cholera toxin in the experiment is 2.5 μg/mL(a)pH dependence of the probe in pH(6.0～8.0);(b)ion-strength dependence of the probe in 10～90 mmol/L NaCl,the pH of the solution is 7.0;(c)frequency responses of the probe,where the volume of the CT antibody labeled silica nanoparticles in probe cell varied from 20 μL to 100 μL,the total volume of the solution in probe cell is 200 μL;(d)comparison of frequency response processes between without(Ⅰ)PEG and(Ⅱ)with PEG amplified immunoagglutinations

實驗通過向緩沖溶液中加入不同濃度NaCl考察了離子強度對免疫凝集反應的影響。從圖2(b)可看出，免疫凝集反應的響應頻移值隨著溶液中NaCl的濃度增加而增加，至NaCl濃度為30 mmol/L時達到峰值。當NaCl濃度超過30 mmol/L時，響應頻移值即隨其濃度的增加而遞減。表明30 mmol/L NaCl為免疫凝集反應適宜的離子強度。適宜的NaCl濃度不僅有助于促進或加速免疫識別/凝集過程[17]，而且對非特異性凝集/吸附具有一定的抑制作用[5]。

實驗通過加入不同用量的霍亂毒素抗體-SiO2顆粒于檢測緩沖液中，檢測池中溶液的總體積為200 μL?？疾炝祟w粒用量對免疫凝集反應的影響。由圖2(c)可知，霍亂毒素抗體-SiO2顆粒濃度對免疫凝集響應的影響明顯，并當顆粒用量為70 μL時響應頻移值最大。這是因為霍亂毒素抗體-SiO2顆粒濃度過低，引起的溶液密度和粘度變化??；而顆粒濃度過高則導致溶液中密度和粘度過大，免疫凝集反應的傳質位阻增加，凝集反應的響應頻移值隨即下降[12]。

聚乙二醇 （PEG）是一種水溶性的聚合物，PEG作為凝集反應促進劑已被廣泛用于膠乳型免疫凝集分析或作為沉淀劑用于不同種類物質的分離。實驗中，通過加入PEG于檢測緩沖溶液中，考察了PEG對霍亂毒素抗體-SiO2顆粒免疫凝集反應的促進作用。圖2（d）比較了實驗使用和未使用PEG進行免疫凝集反應時探針的頻率響應結果。由圖2(d)可知，PEG的應用大幅度地提高了凝集反應的響應頻率值大小及其速率，PEG分子中含有大量醚鍵，可以很容易通過氫鍵與蛋白質分子綁定，從而降低了蛋白質分子與水分子之間的親合力[15]。促進凝聚反應的進行，該實驗中使用PEG的濃度參照文獻[13]，檢測介質中PEG的終濃度為1.5 mg/mL。

2.2 免疫凝聚檢測霍亂毒素

在最優(yōu)化的實驗條件下 （檢測溶液的pH值為 7.0、NaCl濃度為 30 mmol/L、200 μL 檢測介質中抗體標記的納米二氧化硅顆粒為70 μL、溶液中PEG的終濃度為1.5 mg/mL），檢測了一系列不同濃度的霍亂毒素的頻率響應值與濃度關系。圖3為該傳感器的頻率變化值和不同濃度的霍亂毒素之間的校準曲線。如圖3中的插圖 所示，在霍亂毒素濃度為0.50～1.5 μg/mL的范圍內，壓電免疫傳感器的頻率變化值與霍亂毒素濃度成線性關系，相關系數(shù)為0.996。根據(jù)3σ規(guī)則估算出檢測下限為 0.049 3 μg/mL。

圖3 傳感器對霍亂毒素的檢測曲線，內插圖 為線性范圍的線性擬合，實驗數(shù)據(jù)均是在最優(yōu)化條件下獲得，每一個點的數(shù)據(jù)都平行測定三次取平均值，誤差棒所示為三次測定的標準偏差Fig.3 Calibration curve describing the relationship between the frequency responses and varying concentrations of cholera toxin under the optimized conditions.Inset:linear relationship between the frequency responses and the different cholera toxin concentration.Each data point represents the average of the frequency responses of triplicate measurements.The error bars are standard deviations

2.3 傳感器的選擇性實驗

為了驗證免疫凝集檢測的選擇性，該文進行了控制實驗。實驗過程和檢測霍亂毒素相似，將修飾好的壓電傳感探針安裝于盛有130 μL PBS溶液 （pH7.0，1.5 mg/mL PEG，30 mmol/L NaCl）的反應池中，在緩慢攪拌下向反應池中注入70 μL霍亂毒素抗體-SiO2懸濁液.待探針的響應頻率達到穩(wěn)定后，再加入含有一定量的BSA、HAS、羊IgG、兔IgG等干擾物的待測樣品到反應池中。在免疫反應進行期間，頻率響應數(shù)據(jù)均被記錄，直到響應達到平衡。表1描述了該壓電免疫凝集方法對不同檢測物的試驗結果。從表中可知，干擾物蛋白質引起的頻率響應相對于霍亂毒素特異性凝集所引起的頻率響應，可以忽略不計。

3 結論

該文系統(tǒng)研究了基于SiO2納米顆粒免疫凝集的壓電免疫傳感器對霍亂毒素的直接檢測。該壓電免疫凝集檢測體系拓展了LPEIA技術，發(fā)展了一種新的基于凝集反應的免疫檢測方法。實驗中，應用TEM考察并證實了SiO2標記的霍亂毒素抗體與相應抗原霍亂毒素的免疫凝集現(xiàn)象。所研制的霍亂毒素抗體修飾的且用BSA封閉的探針對樣本具有更高的生物相容性與傳感響應性能。這是由于探針的信號通過兩個因素得到有效地放大—溶液性質的變化（密度及粘度）和晶振吸附的抗原－納米顆粒－抗體復合物的質量變化。免疫凝集促進劑PEG及離子強度控制劑NaCl的使用顯著提高了方法的檢測靈敏度并降低了其敏感下限。該方法能夠檢測到霍亂毒素的最低濃度為 0.049 3 μg/mL。

表1 傳感器探針對不同蛋白質的頻率響應Tab.1 Frequency response to cholera toxin,BSA,Goat IgG,Rabbit IgG and HSA evaluated by the developed immunoagglutination system

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