基于葡萄糖氧化酶-空殼鈀修飾的新型葡萄糖傳感器

齊駿飛，楊卉彥，胡 贏，黃杉生

(上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234)

0 引言

人體血液中的各種化學(xué)成分一直是評(píng)價(jià)人體健康狀況的重要信息。而血糖水平則是衡量新陳代謝能力和糖尿病臨床診斷的重要指標(biāo)。糖尿病是我國(guó)的第三大高發(fā)病，對(duì)人體有巨大的危害[1]。如何控制和治療糖尿病已經(jīng)成為一項(xiàng)重要的任務(wù)。是否患有糖尿病，主要根據(jù)患者血液中葡萄糖的濃度水平來(lái)判斷。目前，測(cè)試血糖濃度的方法有三種：顯色法、葡萄糖傳感器及熒光法。三種方法各有優(yōu)點(diǎn)，其中葡萄糖傳感器具有儀器裝置簡(jiǎn)單，選擇性和靈敏度高、檢測(cè)快速、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，在葡萄糖的定量檢測(cè)方面顯示出來(lái)獨(dú)特的優(yōu)越性，所以葡萄糖傳感器的研究備受人們關(guān)注[2]。其中，酶生物傳感器因?yàn)榭祉憫?yīng)，高敏感，特異性和高選擇性而被廣泛關(guān)注。

近年來(lái)，由于納米材料在電學(xué)、光學(xué)、電磁性、催化等方面獨(dú)特的性能，在納米傳感器、納米電子器件以及催化劑等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力[3～7]。其中納米粒子，如鉑納米粒子[8～10]、銅納米粒子[11]等表現(xiàn)出了對(duì)過(guò)氧化氫（H2O2）良好的催化性能并被廣泛的應(yīng)用于傳感器的制備。同時(shí)，合成一些形貌可控的納米材料越來(lái)越受人們的關(guān)注。通過(guò)控制實(shí)驗(yàn)條件，可以制備各種形貌不同的納米材料，如納米纖維，納米齒輪，納米盤(pán)以及如樹(shù)枝、星星或泡沫形狀的各種納米材料[12～13]。但是很少有文獻(xiàn)報(bào)道采用空殼鈀作為敏感元件制備傳感器?？諝げ牧洗砹艘活愋滦偷拇呋阅芰己玫募{米材料[14]，由于它的空殼腔體，空殼納米粒子可以在溶液中高度分散；而且它的比表面積大，暴露的活性位點(diǎn)多，所以能夠有效的提高它催化性能。另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是在催化過(guò)程中，空殼的腔體可以形成一個(gè)微小的反應(yīng)器，充分與被催化的物質(zhì)接觸，從而增強(qiáng)它的催化性能。到目前為止，有很多的葡萄糖傳感器都是通過(guò)葡萄糖氧化酶催化葡萄糖產(chǎn)生過(guò)氧化氫，而過(guò)氧化氫在電極上產(chǎn)生電信號(hào)來(lái)進(jìn)行葡萄糖濃度監(jiān)測(cè)的[15]。所以，降低過(guò)氧化氫在電極上氧化或還原的過(guò)電位就成了很多研究關(guān)注的焦點(diǎn)。而在電極上過(guò)氧化氫發(fā)生氧化或還原一般都是在較高的電位條件下進(jìn)行的，這樣會(huì)導(dǎo)致許多干擾物質(zhì)，如：尿酸、抗壞血酸等等，這樣容易對(duì)葡萄糖的檢測(cè)造成干擾[16]，而采用一種能夠?qū)^(guò)氧化氫具有良好催化還原性能的材料就可以較好的解決這個(gè)問(wèn)題。

該文利用空殼鈀納米粒子對(duì)過(guò)氧化氫具有良好的催化還原性能，能夠有效的降低過(guò)氧化氫在電極上還原的過(guò)電位的特性，將空殼鈀納米粒子和葡萄糖氧化酶（GOD）修飾在玻碳電極（GC）表面，構(gòu)建了新型的葡萄糖傳感器（GOD/hollow Pd/GC）。以循環(huán)伏安等方法研究了傳感器的電化學(xué)響應(yīng)特性，表明該電極能夠有效的用于葡萄糖的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

四丁基溴化膦（Bu4PBr）購(gòu)于百靈威；殼聚糖(Chits)、氯化鈀（PdCl2）、戊二醛購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)上海 分 公 司 ； 葡 萄 糖 氧 化 酶 （GOD）、Na2HPO4、NaH2PO4、H2O2購(gòu)于生活試劑公司；磷酸鹽緩沖液 (PBS) 由 0.1 mol/L Na2HPO4和 0.1 mol/L NaH2PO4配制。實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

電化學(xué)工作站（CHI 760C，上海辰華公司）；實(shí)驗(yàn)中采用三電極體系，修飾電極為工作電極，鉑絲電極為對(duì)電極，飽和甘汞電極為參比電極(SCE)；循環(huán)伏安法（CV）、電化學(xué)阻抗譜圖（EIS）在CHI 760C電化學(xué)工作站 (上海辰華儀器公司，中國(guó))上進(jìn)行，采用三電極體系；透射電子顯微鏡（TEM,JEM-2010,日本）。所有的實(shí)驗(yàn)條件均在室溫下進(jìn)行。

1.2 傳感器的制備

1.2.1 空殼鈀納米粒子的制備

空殼鈀納米粒子的制備根據(jù)Li等報(bào)道的方法進(jìn)行[17]，并在其基礎(chǔ)上進(jìn)行了一定的改進(jìn)。在溫度25℃時(shí)，將320mL含10 mmol/L的Bu4PBr水溶液與16mL 10 mmol/L的PdCl2水溶液混合，混合液置于500mL的反應(yīng)容器內(nèi)，不停地?cái)嚢杓s4 min,在強(qiáng)力攪拌過(guò)程中將一定量的新制備好的KBH4溶液快速加入到上述溶液中，溶液的顏色從桔黃色變成亮黑色，隨著攪拌的進(jìn)行，逐漸變成黑色的懸濁液，繼續(xù)攪拌30 min左右，將產(chǎn)物離心分離，分別用超純水和乙醇反復(fù)洗滌，得到空殼鈀納米球，最后將空殼鈀納米粒子儲(chǔ)存在乙醇溶液中備用。

1.2.2 修飾電極的制備

玻碳電極分別用 1.0、0.3、0.05 mm 的氧化鋁粉末拋光，直至產(chǎn)生一個(gè)光亮、平滑的表面，然后將電極分別置于1∶1的硝酸、無(wú)水乙醇、超純水中超聲清洗3 min,得到干凈的玻碳電極，用氮?dú)獯蹈珊髠溆谩７Q取1 mg的空殼鈀納米顆粒將其溶于0.5%的殼聚糖溶液中，混合液超聲30 min,得到混合均勻分散的電極修飾液，移取8 μL 1 mg/mL的hollow Pd-chit混合液滴涂在處理干凈的玻碳電極表面，在干燥器中室溫晾干；將5 mg GOD 溶解于 1mL 0.1 mol/L PBS(pH=7.0)的PBS中得到葡萄糖氧化酶的溶液濃度為5 mg/mL,然后將5 mg/mL葡萄糖 氧 化 酶溶液 50 μL,5 mg/mL牛血清蛋白溶液50 μL,25 mg/mL戊二醛溶液50 μL充分混合后,取混合液8 μL滴涂到修飾了空殼鈀納米粒子的玻碳電極上，將修飾好的電極放在冰箱中保持4℃干燥過(guò)夜,即得到修飾電極GOD/hollow Pd/GC。修飾電極不用時(shí)保存在 4 ℃下 0.1 mol/L 的 PBS(pH=7.0)中。

2 結(jié)果與討論

2.1 空殼鈀納米粒子的TEM表征

以TEM對(duì)空殼鈀納米粒子的形貌進(jìn)行了表征。圖1為空殼鈀納米粒子的TEM圖，由圖中表明，所制備的空殼鈀納米粒子直徑在50～100 nm之間，且分散程度較好。

圖1 空殼鈀納米粒子的TEM圖Fig.1 TEM images of hollow Pd

2.2 修飾電極的電化學(xué)阻抗譜圖

電化學(xué)阻抗譜圖（EIS）是一種最常用、高靈敏度的界面研究技術(shù)，被廣泛用于修飾電極的界面特性分析。半圓的直徑，也就是電子轉(zhuǎn)移阻抗Ret,可用來(lái)描述電極的界面性質(zhì)。圖2顯示了不同修飾層電極在 10 mmol/L Fe(CN)63-/4-和 0.1 mol/L KNO3溶液中的電化學(xué)阻抗譜圖，各曲線分別代表裸玻碳電極（GC），hollow Pd/GCE 和 GOD/hollow Pd/GCE層層修飾的電極。由圖可知，裸的GC（曲線a）抗圖是一個(gè)半圓，當(dāng)修飾了空殼鈀納米粒子后，曲線b的半圓的直徑明顯變小，這歸功于空殼納米粒子具有能夠作為微小的導(dǎo)電中心，從而使得電子轉(zhuǎn)移更加容易，這個(gè)現(xiàn)象說(shuō)明修飾了空殼鈀納米粒子后電極的電子傳遞性能增加；曲線c是修飾了葡萄糖氧化酶后的電化學(xué)阻抗曲線，由圖可以看出曲線c的半圓的直徑明顯變大，這是因?yàn)殡姌O表面修飾的酶阻礙了Fe(CN)63-/4-在電極表面的電子傳遞過(guò)程。通過(guò)電化學(xué)阻抗譜圖的表征，可以看到空殼鈀能夠增強(qiáng)電極表面的電子傳導(dǎo)能力；通過(guò)各修飾層阻抗曲線的變化，表明電極的修飾是成功的。

圖2 不同修飾層電極的阻抗譜圖（a）裸 GC；（b）hollow Pd/GC；（c）GOD/hollow Pd/GCFig.2 The EIS images of different layers modified electrode

2.3 空殼鈀納米粒子對(duì)H2O2的催化還原表征

在許多研究中，基于葡萄糖氧化酶制備的葡萄糖傳感器所產(chǎn)生的電信號(hào)很多都是由中間產(chǎn)物H2O2所產(chǎn)生的。修飾電極與底液接觸后，溶液中的葡萄糖分子擴(kuò)散到電極的表面，在氧存在條件下葡萄糖分子被GOD催化氧化成葡萄糖酸內(nèi)酯，同時(shí)生成H2O2，H2O2被氧化或還原，從而在電路中產(chǎn)生響應(yīng)電流，如反應(yīng)式（1），（2）所示。因此可以通過(guò)檢測(cè)H2O2在電極上產(chǎn)生的響應(yīng)電流來(lái)測(cè)定葡萄糖的濃度[18～20]。

眾所周知，H2O2在裸的玻碳電極上也可以發(fā)生氧化或還原，但是氧化或還原的電位均較高，從而引起較大的背景電流和較多干擾物質(zhì)的影響。此外，利用過(guò)氧化氫在電極上氧化產(chǎn)生電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，許多還原性的干擾物，如：尿酸、抗壞血酸等也容易被氧化從而產(chǎn)生較大的干擾電流。所以，選擇一種新型的催化材料能夠催化過(guò)氧化氫還原從而降低過(guò)氧化氫在電極上還原的過(guò)電位，可以有效的解決上述兩個(gè)問(wèn)題。為了探討hollow Pd對(duì)H2O2的催化還原作用，以循環(huán)伏安法對(duì)其進(jìn)行了研究。圖3顯示hollow Pd/GC和裸 GC（內(nèi)插圖 ）在不含 H2O2(曲線 a)和含有H2O2(曲線b)溶液中的循環(huán)伏安曲線。由內(nèi)插圖 可以看到，在裸GC上H2O2的還原要在-0.6 V后才能發(fā)生，而且響應(yīng)電流很小；然而，在修飾電極hollow Pd/GC 上， 自-0.2 V 開(kāi)始，H2O2就可以發(fā)生還原反應(yīng)，而且產(chǎn)生的響應(yīng)電流明顯增大。這些現(xiàn)象都?xì)w因于空殼鈀納米粒子對(duì)過(guò)氧化氫具有良好的催化還原性能，有效的降低了過(guò)氧化氫還原的過(guò)電位，同時(shí)增大了響應(yīng)電流。所以，選擇空殼鈀催化葡萄糖氧化的中間產(chǎn)物H2O2，可以通過(guò)檢測(cè)過(guò)氧化氫產(chǎn)生的電信號(hào)，來(lái)得到響應(yīng)電流與葡萄糖濃度之間的關(guān)系，該傳感器有效的降低了還原的過(guò)電位，排除了干擾，提高了電流響應(yīng)。

圖3 不同修飾層電極裸GC（內(nèi)插圖 ）和hollow Pd/GC在不含H2O2（a）和含有H2O2（b）時(shí)的循環(huán)伏安圖，底液為 0.1 mol/L PBS（pH=7.0）；掃描速度：100 mV/sFig.3 The cyclic voltammograms of every layer modified electrodes in 0.1 mol/L PBS(pH=7.0）without(a)and with(b)H2O2;Scan rate:100 mV/s

2.4 實(shí)驗(yàn)最佳條件的選擇

2.4.1 pH的選擇

因?yàn)槊傅幕钚允艿饺芤核釅A性的影響，所以實(shí)驗(yàn)中考察了pH值對(duì)傳感器響應(yīng)電流的影響。圖4為不同pH與響應(yīng)電流之間的關(guān)系，由圖4中可以看出，當(dāng)?shù)滓旱膒H值小于7時(shí)，響應(yīng)電流隨著pH的增大而增大；當(dāng)pH值等于7時(shí)，響應(yīng)電流達(dá)到最大值，此時(shí)葡萄糖氧化酶的活性最好；而當(dāng)pH值大于7時(shí)，隨著pH值的增大，響應(yīng)電流反而變小，這是因?yàn)樗嵝曰驂A性過(guò)強(qiáng)都會(huì)使得酶的活性下降。因此，在該實(shí)驗(yàn)中，選擇pH值等于7.0的PBS作為測(cè)試底液。

2.4.2 溫度的選擇

圖4 不同pH對(duì)傳感器響應(yīng)電流的影響Fig.4 Effect of pH on the current response of modified electrode

溫度的變化將影響酶的活性和酶的催化速率，該實(shí)驗(yàn)考察了在10℃～50℃范圍內(nèi)響應(yīng)電流和溫度之間的關(guān)系。圖5 顯示修飾電極產(chǎn)生的響應(yīng)電流和不同溫度之間的關(guān)系曲線圖。從圖中可見(jiàn)，在10℃～35℃范圍內(nèi)響應(yīng)電流隨著溫度的升高而增大，但是當(dāng)溫度超過(guò)35℃時(shí)，響應(yīng)電流急劇減小，這可能是由于溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致酶的活性降低而引起的。考慮到酶電極的使用壽命和電極靈敏度等因素，實(shí)驗(yàn)中選擇30℃作為實(shí)驗(yàn)溫度。

圖5 溫度對(duì)傳感器響應(yīng)電流的影響Fig.5 Effect of temperature on the current response of modified electrode

2.4.3 工作電位的選擇

該葡萄糖傳感器是基于空殼鈀催化還原過(guò)氧化氫產(chǎn)生電信號(hào)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的，實(shí)驗(yàn)采用計(jì)時(shí)電流法測(cè)定葡萄糖。過(guò)氧化氫在hollow Pd/GC上的還原從-0.2 V開(kāi)始，所以考察了不同電位對(duì)響應(yīng)電流的影響（圖6）。從圖6可見(jiàn)，在-0.30 V和-0.35 V電位處，響應(yīng)電流接近最大值，但是電位較低時(shí)產(chǎn)生的背景電流干擾較小，所以實(shí)驗(yàn)中選擇-0.30 V作為工作電位。

圖6 不同工作電位對(duì)響應(yīng)電流的影響Fig.6 Effect of the working potential on the current response of modified electrode

2.5 葡萄糖在傳感器的電化學(xué)響應(yīng)

圖7為在0.1 mol/L PBS(pH=7.0)溶液中，葡萄糖在GOD/hollow Pd/GC上計(jì)時(shí)電流響應(yīng)圖（內(nèi)插圖 是相應(yīng)的線性校準(zhǔn)曲線）。從圖中可以看出，在 2.5×10-5mol/L 到 2.7×10-3mol/L 的范圍內(nèi)傳感器線性響應(yīng)良好，線性相關(guān)方程為：I（μA）=1.095+2.023c（mmol/L），相關(guān)系數(shù)為 0.999 9。最低檢測(cè)限為 10 μmol/L（三倍信噪比）。

圖7 葡萄糖在GOD/hollow Pd/GC的計(jì)時(shí)電流響應(yīng)曲線；底液:0.1 mol/L的PBS（pH=7.0），葡萄糖加入的濃度梯度為0.1 mmol/L，工作電位：-0.3 VFig.7 Current-time response obtained by successive addition of 0.1 mmol/L glucose into the test solution at GOD/hollow Pd/GC.The applied potential was-0.3 V,solution:0.1 mol/L PBS（pH=7.0）

實(shí)驗(yàn)考察了傳感器的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及抗干擾性。在 5mL 0.1 mol/L 的 PBS(pH=7.0)的溶液中加入2.0×10-6mol/L葡萄糖溶液，連續(xù)測(cè)定8次，得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.3%，說(shuō)明該傳感器具有較好的重現(xiàn)性。把該傳感器保存在4℃PBS（pH=7.0）中，兩個(gè)星期后，傳感器的響應(yīng)信號(hào)為初始信號(hào)的90%左右，說(shuō)明該傳感器具有較好的穩(wěn)定性。維持葡萄糖的濃度為0.1 mmol/L,實(shí)驗(yàn)考察了傳感器的抗干擾性，對(duì)可能造成干擾的物質(zhì)，如：尿酸、抗壞血酸、L-半胱氨酸等進(jìn)行了干擾測(cè)定，數(shù)據(jù)顯示幾乎沒(méi)有干擾。這歸功于該葡萄糖傳感器的工作電位是負(fù)電位，而這些干擾物質(zhì)屬于還原性的物質(zhì)，所以在此工作電位下不會(huì)發(fā)生還原反應(yīng)而產(chǎn)生干擾。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

取市售的葡萄糖注射液作為實(shí)驗(yàn)測(cè)定的實(shí)際樣品，對(duì)其進(jìn)行稀釋，取3份稀釋后的葡萄糖注射液，分別向3份實(shí)際樣品中加入1.0 mmol/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行回收率的測(cè)定。結(jié)果如表1所示，該方法測(cè)定的回收率為 96.8%～103.1%。說(shuō)明該方法制備的葡萄糖傳感器為測(cè)定葡萄糖實(shí)際含量提供了一種較為準(zhǔn)確的方法。

表1 樣品的檢測(cè)(n=3)Tab.1 Determination results of samples(n=3)

3 結(jié)論

該文報(bào)道了一種新型的葡萄糖生物傳感器。該傳感器是通過(guò)在玻碳電極表面修飾空殼鈀，然后再固定葡萄糖氧化酶來(lái)制備的。利用空殼鈀可以催化還原過(guò)氧化氫，通過(guò)測(cè)定酶反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫來(lái)測(cè)定葡萄糖。實(shí)驗(yàn)表明，空殼鈀對(duì)過(guò)氧化氫具有良好的催化還原作用，通過(guò)計(jì)時(shí)電流法表明在一定濃度范圍內(nèi)響應(yīng)電流與葡萄糖的濃度成較好的線性關(guān)系。此外，該傳感器還具有穩(wěn)定性好，抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)，為檢測(cè)葡萄糖提供了一種簡(jiǎn)單有效的方法。

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