王新帥，秦 玲，馮笑山，高社干，祁巖超

大量研究顯示腫瘤患者免疫功能低下，腫瘤細胞通過多種機制逃逸機體免疫系統(tǒng)的識別［1］。樹突狀細胞(DCs)是體內(nèi)最強的抗原提呈細胞，是機體免疫應答的始動者。通過外源的腫瘤抗原負荷DCs增強其免疫性及抗原遞呈作用，以DC 為基礎的腫瘤免疫治療已成為當今腫瘤治療的研究熱點。本研究采用負荷CEA-rV 負荷臍血來源的DC 后，再與細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine induced kill cell，CIK)混合培養(yǎng)，觀察CEA－rV－DC－CIK 對結腸癌細胞株Lovo 的殺傷活性，從而為CEA 陽性表達腫瘤細胞免疫治療提供實驗依據(jù)和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 IL-2、IFN-γ、GM-CSF(grannulocyte monocyte-colony stimulating factor)、TNF-α 及CD3 單抗購自美國Cytolab 公司;PGE2(Prostaglandin E2)購自美國Cayman 公司;鼠抗人CD40、CD80、CD83、CD86 熒光抗體購自美國eBioscience 公司;RPMI 1640 購自美國Gibco 公司;MTT 購自美國Sigma 公司;新生小牛血清購自杭州四季青生物公司;淋巴細胞分離液購自中國醫(yī)學科學院血液病研究所;蛋白提取試劑盒購自中國康成生物公司;人結腸癌細胞株Lovo 由廣州醫(yī)學院腫瘤研究所提供;酶標儀為美國Thermo Labsystem 生產(chǎn)的MK3 型。

1.2 實驗方法

1.2.1 CEA-rV 的制備及滴度測定 CEA-rV 的制備及滴度測定依照參考文獻［2］中方法進行，進行滴度測定后置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 臍血的采集和分離 臍血樣本來自廣州市荔灣醫(yī)院，共10 份。其孕母HBV、HCV、HIV 和梅毒檢測陰性。用淋巴細胞分離液經(jīng)密度梯度離心法分離臍血單個核細胞(cord blood mononuclear cells，CBMC)。

1.2.3 DC 和CIK 的誘導 ①DC 的誘導:取分離的CBMC 置入6 孔培養(yǎng)板，2 h 后吸出懸浮細胞，貼壁細胞中加入20 ng/mL IL-4 和100 ng/mL GM-CSF，隔天換液，誘導培養(yǎng)前期加入CEA-rV，后期加入20 ng/mL TNF-α 和1 μg/mL PGE2。②CIK 的誘導:懸浮細胞中加入1 000 μg/mL IFN-γ、500 ng/mL CD3單抗、200 μg/mL IL-2，每2 ～3 d 傳代培養(yǎng)1 次，傳代時補加細胞因子。

1.2.4 DC 的形態(tài)和免疫學鑒定 應用倒置顯微鏡、透射電鏡、掃描電鏡鑒定成熟DC 的形態(tài)。采用流式細胞儀(美國BD 公司)的Cellquest 軟件分析成熟DC 的免疫學CD 分子表型，加鼠抗人CD40、CD80、CD83、CD86 熒光抗體及其對照品，4℃避光標記30 min 后上機檢測。

1.2.5 實驗分組 實驗共分4 組:①CBMC 組:未經(jīng)誘導的CBMC;②CIK 組:未經(jīng)腫瘤抗原刺激的CIK;③DC-CIK 組:DC 與CIK 混合培養(yǎng);④CEA-rV-DCCIK 組:負載CEA-rV 的DC 和CIK 按1∶10 的比例混合培養(yǎng)。

1.2.6 各組細胞殺傷活性的測定 將各組效應細胞與Lovo 細胞按10∶1 的比例放入96 孔板，另設單獨Lovo 細胞組和單獨效應細胞組，每組設3 個復孔。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，應用MTT 法［3］在酶標儀上測定各組細胞在570 nm 處吸光度(A)值，取3 個復孔的均值作為測定結果，殺傷活性的計算公式:殺傷活性(%)=［(靶細胞OD 值+效應細胞OD 值－實驗組OD 值)/靶細胞OD 值］×100%。

2 結果

2.1 DC 的形態(tài)學鑒定結果 在培養(yǎng)前3 d 大部分DC 細胞貼壁生長，細胞形態(tài)出現(xiàn)不規(guī)則改變，少量細胞懸浮并可見少量突起。加入TNF-α 和PGE2后，大量細胞懸浮，突起明顯增多。培養(yǎng)10 d 的成熟DC 表面有大量突起和明顯的偽足，表面凸凹不平(圖1A)。透射電鏡顯示細胞形態(tài)不規(guī)則，胞漿豐富，見多個線粒體和電子密度高低不均的大量溶酶體，粗面內(nèi)質網(wǎng)增生活躍及大量的吞噬小體(圖1B)。掃描電鏡可見DC 的胞體呈多角形、橢圓形、圓形，表面有大量的片狀突起和長的突起，其突起又有細小的分枝，分枝末端又可分成細小的絲狀偽足(圖1C)。

圖1 成熟DC 的形態(tài)學鑒定結果

2.2 DC 的免疫分子表型結果 成熟DC 表達主要組織相容性抗原Ⅰ、Ⅱ類分子CD86、CD80、CD83 和CD40，其中高表達CD86 和CD40，中度表達CD83 和CD80，表達率分別為(82. 66 ±6. 22)%、(69. 40 ±6.82)%、(57.49 ±6.59)%和(51.14 ±6.31)%，流式細胞儀Cellquest 軟件對DC 免疫分子表型的分析結果見圖2。

圖2 流式細胞儀對DC 免疫分子表型的分析結果

2.3 各組細胞對Lovo 細胞株的殺傷結果 CBMC組、CIK 組、DC-CIK 組、Ag-DC-CIK 組對靶細胞Lovo的殺傷活性分別為29. 31%、42.12%、44. 81% 和58.98%;單因素方差分析結果顯示差異有統(tǒng)計學意義(F=25.169，P =0.001);其中CEA-rv-DC-CIK 組對Lovo 的殺傷活性比另外3 組高，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。具體結果見表1。

表1 各組細胞對Lovo 細胞株的殺傷結果(±s，%)

表1 各組細胞對Lovo 細胞株的殺傷結果(±s，%)

①任兩組比較P ＜0.05

分 組 n 殺傷活性CBMC 組 10 29.31 ±5.63①CIK 組 10 42.12 ±3.92①DC-CIK 組 10 44.81 ±4.24①CEA-rV-DC-CIK 組 10 58.98 ±7.36①F 值 25.169 P 值0.001

3 討論

腫瘤病人免疫功能低下，在腫瘤微環(huán)境影響下DC 功能受抑，腫瘤病人的樹突狀細胞(DCs)存在免疫功能缺陷，不能引發(fā)有效的抗腫瘤免疫反應［4，5］。MHC 限制性又嚴重影響異體DCs 輸注治療腫瘤的臨床應用。臍血細胞免疫原性弱，含大量造血干細胞。如果從臍血中培養(yǎng)腫瘤抗原特異性的DCs，用于治療腫瘤，將會大大促進DCs 免疫治療腫瘤的臨床應用［6］。CEA-rV 是用天壇株761 痘苗病毒為截體，以CEA 抗原DNA 為目的基因構建的既有CEA抗原的高表達，又可刺激機體產(chǎn)生CEA 抗體的重組基因痘苗病毒，動物實驗表明，單用CEA-rV 皮下注射，對CEA 陽性的腫瘤有明顯的預防和治療作用［7］。

本研究中將CBMC 誘導分化為DC，并對成熟DC 進行了形態(tài)學鑒定。當DC 在加入TNF-α 和PGE2 后，大量細胞懸浮，突起明顯增多，細胞表面有大量突起和明顯的偽足，表面凸凹不平。透射電鏡可見胞漿豐富，多個線粒體和大量溶酶體，粗面內(nèi)質網(wǎng)增生活躍及大量的吞噬小體。掃描電鏡可見細胞表面有大量的片狀突起和長的突起，其突起又有細小的分枝，分枝末端又可分成細小的絲狀偽足。免疫學鑒定顯示成熟DC 高度表達CD86 和CD40，中度表達CD83 和CD80，CD86 是DC 成熟的重要標志，表達率為82. 66%。本研究結果顯示CEA-rVDC-CIK 組比其余各組的殺傷活性高，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。說明經(jīng)CEA-rV 抗原負載的DC 與CIK 混合培養(yǎng)后，成熟的DC 以MHC 限制的方式處理CEA 抗原，并將該信號呈遞給CIK，從而增強了特異性CIK 對CEA 陽性表達腫瘤Lovo 細胞株的特異識別和殺傷能力。

綜上所述，經(jīng)CEA-rV 負荷CBMC 誘導生成的DC，能進一步激活CIK，對Lovo 細胞株產(chǎn)生高效而特異的殺傷作用，其殺傷活性明顯高于CIK 和DC-CIK，為CEA 陽性表達腫瘤的細胞免疫治療提供了實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。此外臍血是一個較好的CIK 的來源，又因臍血來源豐富，質量標準易于控制，這也為CIK免疫治療技術的常規(guī)臨床應用提供了方便。

［1］De Vleeschouwer S，F(xiàn)ieuws S，Rutkowski S，et al.Postoperative adjuvant dendritic cell-based immunotherapy in patients with relapsed glioblastoma multiform［J］.Clin Cancer Res. 2008;14(10):3098－3104.

［2］楊潔，羅超權，盧方安.人癌胚抗原重組痘苗病毒的構建和制備［J］.中國生物化學與分子生物學，1999，15(1):54－58.

［3］張志強，田志剛，崔正言，等. MTT 法檢測NK 和LAK 活性的方法學探討［J］. 中國實驗臨床免疫學雜志，1994，6(1):12.

［4］Joshi PS，Liu JQ，Wang Y，et al. Cytokine-induced killer T cells kill immature dendritic cells by TCR-independent and perforin-dependent mechanisms［J］. J Leukoc Biol，2006，80(6):1345－1353.

［5］Introna M，F(xiàn)ranceschetti M，Ciocca A，et al. A rapid and massive expansion of cord blood-derived cytokine-induced killer cells:an innovative proposal for the treatment of leukemia relapse after cord blood transplantation［J］.Bone Marrow Transplant，2006，38(9):621－627.

［6］Weng DS，Zhou J，Zhou QM，et al.Minimally invasive treatment combined with cytokine-induced killer cells therapy lower the short-term recurrence rates of hepatocellular carcinomas［J］. J Immunother，2008，31(1):63－71.

［7］Qi YC，Wang XS，Yang B，et al. Preventive and therapeutic effects of CEA recombinant vaccinia virus on CEA positive tumor［J］.J Tumor Marker Oncol，2004，19:409－413.