黨玉麗，哈斯通拉嘎，耿靜微，王瑞寧，郭東輝，胡清林，魏戰(zhàn)勇

(1.河南農業(yè)大學理學院，河南 鄭州 450002;2.鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W校，河南 鄭州 450011;3.河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002)

豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起妊娠母豬繁殖障礙的主要病原體之一.初產妊娠母豬感染后，經胎盤侵襲胚胎或胎兒，引起母豬流產、胚胎死亡、胎兒畸形及木乃伊化，致使母豬不孕或反復發(fā)情，同時還可引起仔豬的皮炎和腹瀉［1］.豬細小病毒在豬群中檢出率甚高，在豬群中的血清抗體陽性率達50% ～80%［2］.炎性細胞因子特別是白細胞介素具有介導天然免疫、調節(jié)淋巴細胞活化、生長和分化等免疫調節(jié)作用，是目前臨床醫(yī)學、免疫學和腫瘤學等領域的研究熱點之一［3］.體內白細胞介素的表達發(fā)生異常，與機體免疫功能低下或發(fā)生病理損傷有關［4］.對炎性細胞因子特別是白細胞介素表達量的準確測定、反應機體的免疫狀態(tài)、揭示疾病的發(fā)病機理、探索感染后機體的免疫應答規(guī)律均具有重要意義.常用的檢測白細胞介素(Interleukin，IL)等細胞因子的方法(放射免疫法，ELISA，MTT法)不同程度上存在靈敏度不高、污染環(huán)境、費時、操作復雜和難以準確定量等缺點.實時熒光定量PCR技術以其準確、快速、定量的優(yōu)點，迅速被應用于功能基因組、分子醫(yī)學、病毒學、微生物學及生物工藝學等領域［5］，也是測定在細胞因子的表達研究方面主要手段之一.本試驗利用SYBR Green I實時定量PCR檢測方法，分不同時間點定量檢測PPV感染Marc-145后IL-18 mRNA的表達水平.為研究IL-18的抗細小病毒機制提供理論參考和試驗依據(jù)，并為預防控制PPV提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 豬細小病毒7909標準毒株(PPV-7909)購自中國獸藥監(jiān)察所，病毒滴度為 106.1TCID50·mL－1.

1.1.2 細胞Marc-145 細胞為河南省動物性食品安全重點實驗室保存，細胞生長于含10%新生犢牛血清的 DMEM培養(yǎng)基中，于體積分數(shù)為5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.1.3 試劑 Protein K(Promega公司);DMEM培養(yǎng)基(GIBCOBR公司);Trypsin(Invitrogen);胎牛血清(Hyclone公司);E.Z.N.A Total RNA KitⅠ(OMEGA);SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa);RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(MBI Fermentas);其它常規(guī)試劑均為分析純.

1.1.4 儀器 Mastercycle ep realplex Real-Time PCR儀(Eppendorf公司);臺式高速低溫離心機(德國 Sigma公司);PTC－200型 PCR儀(M J Research公司);紫外凝膠成像系統(tǒng)(美國SIM公司);小型臺式離心機(德國Sigma公司).

1.2 病毒感染

將Marc-145細胞用胰酶溶液分散后，培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板(2×105個·孔－1)，培養(yǎng)細胞豐度達80%后，用PBS洗2次，將PPV接種于Marc-145細胞，吸附60 min，每隔15 min輕輕晃動1次，洗去未吸附的病毒，添加含有體積分數(shù)為2%胎牛血清的DMEM維持液.

1.3 細胞的收集

將病毒感染后 1，3，24，48 h的細胞分別用PBS洗2次，添加0.25%胰酶消化細胞，1 000×g離心10 min收集Marc-145細胞，保存于－80℃?zhèn)溆?

1.4 DNA及RNA的提取和反轉錄

按蛋白酶K法提取病毒DNA，參照E.Z.N.A Total RNA KitⅠ說明書提取細胞總RNA，具體方法和步驟參照文獻［6］進行，以提取的總RNA為模板進行反轉錄，反轉錄合成的cDNA及提取的DNA作為熒光定量PCR模板.

1.5 引物和相對定量PCR

引物的設計使用Primer Premier 5.0軟件，參照GenBank公布序列進行(表1).熒光定量PCR反應體系為 20 μL.其中，SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上、下游引物各 0.4 μL，cDNA 600 ng.反應條件為:95℃，1 min;95℃，10 s;57℃，15 s;72℃，15 s，共進行40個循環(huán)，循環(huán)結束后升溫至95℃，15 s，再降至60℃，15 s，開始從60℃遞增至95℃，20 min，采集熒光信號得出擴增產物的溶解曲線，于95℃，15 s結束反應.

表1 Real-time PCR引物及其反應條件Table 1 Primers and conditions used for Real-time PCR assays

1.6 數(shù)據(jù)處理

在實時定量PCR中，Ct值是反映模板中目標基因含量的重要指標，通過樣品和標準曲線Ct值比較，可以準確計算出RNA含量.另外，將目標基因與持家基因β-actin比較，消除由于收集細胞、反轉錄和加樣中操作誤差.將0 h未接種病毒的細胞因子的表達量設為1倍，使用Mastercycle ep realplex Real-Time PCR軟件分析各基因相對于0 h的表達量變化水平.

2 結果與分析

2.1 PPV DNA水平測定

Marc-145 單層細胞感染 PPV 后，在1，3，24，48 h分別收集細胞，提取DNA，做熒光定量PCR，與β-actin進行比較分析，并將病毒感染1 h時病毒DNA含量定義為1倍，得出不同時間病毒DNA在細胞的增殖倍數(shù)(圖1).

圖1 PPV在Marc-145細胞中增殖規(guī)律Fig.1 The replication of PPV in Marc-145 cell

由圖1可知，病毒感染后1 h就可以檢測到病毒DNA，但病毒量相對較低;隨后開始逐步上升，在感染后24 h病毒開始大量迅速增殖，48 h達到最高峰，從感染后24 h的13倍增殖到170倍.

2.2 細胞因子的測定

Marc-145單層細胞在感染 PPV 后 1，3，24，48 h分別收集細胞，提取RNA，反轉錄獲得cDNA，做熒光定量PCR，并與β-actin進行比較分析，并以病毒感染0 h時mRNA含量定義為1倍，得出不同時間細胞因子RNA在細胞的增殖倍數(shù)(圖2).

圖2 白細胞介素18的轉錄時相Fig.2 The transcriptional profiles of interleukin-18

由圖2可知，IL-18的表達量在1 h無明顯變化，3，24 h增加，48 h輕微下降低于細胞對照水平.

3 討論

1)實時熒光定量PCR技術不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量檢測的飛躍，而且所有反應均在同一溶液中進行，不需任何后處理過程，具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高、能實現(xiàn)多重反應、定量結果具實時性和準確性等特點［7］.目前在不同的研究領域得到廣泛的應用.PPV可以在ST，PK-15，Marc-45等多種細胞中增殖并引起細胞病變.本研究發(fā)現(xiàn)在PPV感染Marc-145細胞后1 h能檢測到病毒，24 h后開始大量增殖，在感染后48 h達最高峰，達到170倍，這可能是由于病毒大量增殖，釋放所致.

2)IL-18是一種高活性、多功能的生物活性糖蛋白，不僅可刺激Thl細胞高水平誘生IFN-γ，GMCSF，IL-2等細胞因子，而且可以直接激活IFN-γ的啟動子，其誘導IFN-γ產生的能力比IL-12還強很多，促進免疫細胞表達FasL，增強FasL介導的細胞毒作用，促進T細胞的增殖，顯著增強Thl細胞和NK細胞的細胞毒作用等免疫調節(jié)功能［8］.此外，IL-18具有抗病毒、抗結核分支桿菌、抗真菌、抗腫瘤免疫、抗變態(tài)反應性疾病作用及前炎因子活性，提高機體的細胞免疫水平，達到預防和控制微生物感染、抑制腫瘤發(fā)生的目的［9］.本研究發(fā)現(xiàn)，PPV感染Marc-145細胞后IL-18的表達量在3，24 h增加，48 h輕微下調.LIU等［10］發(fā)現(xiàn) IL-18在宿主防御系統(tǒng)對抗流感病毒感染試驗中，IL-18參與抑制流感病毒復制，尤其是在感染早期階段激活NK活性，并增強NK細胞的細胞毒作用.表明IL-18可能在Marc-145細胞防御和抵抗PPV感染過程中起重要作用，PPV感染Marc-14初期能夠引起細胞炎性反應，而當病毒大量增殖后又能夠抑制細胞炎性反應、抑制NK等免疫細胞活性.

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