趙仲麟，頓文濤，李 燕，金顯春，楊國(guó)玉，蘇同福，袁 超

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，河南 鄭州 450002;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)信息化管理處，河南 鄭州 450002;3.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能為基礎(chǔ)，從分子水平上認(rèn)識(shí)生命現(xiàn)象已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展的主要方向.研究蛋白質(zhì)首先要得到高度純化并具有生物活性的蛋白質(zhì)，常用于純化蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)方法有凝膠過(guò)濾和離子交換等，但是這些方法要求操作人員有較為豐富的經(jīng)驗(yàn).親和層析也是一種常用的蛋白純化方法，利用共價(jià)連接有特異配體的層析介質(zhì)分離蛋白質(zhì)，具有高效、快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是親和標(biāo)簽可能對(duì)目的蛋白產(chǎn)生影響，常需要使用蛋白酶除去親和標(biāo)簽，而蛋白酶處理有時(shí)非特異，且效率較低，同時(shí)也將增加蛋白純化的步驟.內(nèi)含肽(intein)是類(lèi)似內(nèi)含子的蛋白質(zhì)等價(jià)物，通過(guò)翻譯后蛋白剪接過(guò)程催化其自身從宿主蛋白上脫離［1，2］.由內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接原理發(fā)展出多種新技術(shù)已用于蛋白質(zhì)工程和化學(xué)生物學(xué)研究中［3～5］.內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)純化方法可通過(guò)親和層析的方法得到無(wú)親和標(biāo)簽的蛋白，剪切能夠在不使用蛋白酶的情況下切斷肽鍵.CHONG等［6］利用釀酒酵母 Sce VMA內(nèi)含肽進(jìn)行了蛋白純化.目的蛋白被融合在內(nèi)含肽的N端，內(nèi)含肽的C端連接到環(huán)狀芽胞桿菌的幾丁質(zhì)結(jié)合域(CBD)的親和尾上，硫醇誘導(dǎo)內(nèi)含肽N端的肽鍵的斷裂，從固定在柱上的融合蛋白上釋放目的蛋白.ZHAO等［7］利用雙內(nèi)含肽的方法對(duì)綠色熒光蛋白進(jìn)行了純化.內(nèi)含肽蛋白純化系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于該方法簡(jiǎn)單、高效，可得到無(wú)載體來(lái)源氨基酸的蛋白質(zhì)，分離蛋白質(zhì)不需要使用昂貴的蛋白酶切除親和標(biāo)簽.本研究利用來(lái)源于藍(lán)綠藻Synechocystis sp.PCC6803的DnaB內(nèi)含肽的剪切特性，純化綠色熒光蛋白.

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

載體pTWIN1和大腸桿菌E.coli ER2566由NEB公司徐明群博士惠贈(zèng).

1.2 酶和試劑

限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、幾丁質(zhì)樹(shù)脂均購(gòu)于NEB(北京)公司;高保真DNA聚合酶購(gòu)自全式金公司;其它試劑均為分析純.

1.3 綠色熒光蛋白基因(gfp)的克隆

根據(jù)gfp基因序列設(shè)計(jì)引物，分別加入位點(diǎn)EcoR I和Xho I(下劃線(xiàn)部分).引物由上海生物工程有限公司合成，分別為:gfpF:5’-CCAGAATTCAT GCGTAAAGGAGAAGAAC-3’，gfpR:5’-CCACTCGA GTCATTTGTATAGTTCATC-3’.以含 gfp基因的質(zhì)粒pG6th為模板，PCR擴(kuò)增出全長(zhǎng)的綠色熒光蛋白基因.PCR參數(shù)為:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸 50 s，共 30 個(gè)循環(huán)，最后72℃補(bǔ)充延伸10 min.

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂凝膠電泳純化回收，用EcoR I和Xho I雙酶切，同時(shí)使用相同內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒pTWIN1酶切.用T4 DNA連接酶將酶切后的pTWIN1和gfp于4℃連接過(guò)夜.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 ER2566，涂布在含100 mg·L－1的氨芐霉素抗性的LB平板上，37℃培養(yǎng)12 h，得到含重組質(zhì)粒pTWG的大腸桿菌.

1.5 綠色熒光蛋白的表達(dá)與純化

將含重組質(zhì)粒pTWG的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子接種于LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃，200 r·min－1過(guò)夜培養(yǎng)后，按1%接種量轉(zhuǎn)接入100 mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至 OD600為0.6，加入 IPTG使終濃度達(dá)到0.3 mmol·L－1，15 ℃培養(yǎng)16 h.離心收集菌體，用10 mL 緩沖液 B1(20 mmol·L－1Tris-HCl，pH 7.0，0.5 mol·L－1NaCl，1 mmol·L－1EDTA)將菌體重懸，超聲波破碎細(xì)胞，后19 000×g離心30 min，上清液即為澄清的細(xì)胞粗提物.

將3 mL幾丁質(zhì)樹(shù)脂倒入柱中，30 mL B1緩沖液(pH 7.0)，4℃進(jìn)行柱平衡.將澄清的細(xì)胞粗提物緩慢加入幾丁質(zhì)柱，流速約為1.0 mL·min－1.用50 mL的緩沖液徹底洗柱，流速為3 mL·min－1.停止柱流后，pH 7.0 條件下，20 ℃ 放置 12 h，后用10 mL B1緩沖液洗脫目的蛋白，SDS-PAGE電泳檢測(cè).

1.6 激光共聚焦影像試驗(yàn)

從含pTWG質(zhì)粒的大腸桿菌2566平板上挑取單菌落，接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基(含氨芐100 mg·L－1)，加入 IPTG，15 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng) 16 h后，5 000×g離心5 min，收集細(xì)胞，棄上清液.用無(wú)菌水洗菌體3次，取10 μL至于載玻片上，100倍油鏡鏡檢，使用德國(guó)Leica TCS SP2激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm.

2 結(jié)果與分析

2.1 綠色熒光蛋白基因的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)綠色熒光蛋白gfp基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增出1條長(zhǎng)度約為720 bp的條帶(圖1)，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證表明基因無(wú)突變.

圖1 gfp基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR result of gfp gene

將PCR產(chǎn)物與酶切后的pTWIN1載體連接后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌ER2566感受態(tài)細(xì)胞.通過(guò)氨芐霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR驗(yàn)證表明已成功將gfp基因連接到表達(dá)載體上，產(chǎn)生載體命名為pTWG(圖2).其中Ssp DnaB內(nèi)含肽融合于gfp基因的N端，幾丁質(zhì)親和域CBD融合于DnaB內(nèi)含肽的N端，作為親和純化標(biāo)簽.

2.2 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化

本研究使用0.3 mmol·L－1的 IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá).細(xì)胞粗提液通過(guò)親和層析柱時(shí)，內(nèi)含肽－綠色熒光蛋白融合體結(jié)合于幾丁質(zhì)樹(shù)脂柱上.之后于20℃，pH 7.0條件下放置12 h誘導(dǎo)內(nèi)含肽的自剪切活性，將綠色熒光蛋白從融合前體上脫離，后用緩沖液B1洗脫目的蛋白.SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果只出現(xiàn)1個(gè)條帶，大小約29 kD(圖3)，符合綠色熒光蛋白的理論分子量，結(jié)果表明純化得到的綠色熒光蛋白具有正確的大小，且具有較高的純度.

2.3 菌體激光共聚焦掃描結(jié)果

綠色熒光蛋白較適合在低溫下、長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)其表達(dá)［8］，因此本研究中采用15℃誘導(dǎo)16 h，取得了較好的表達(dá)效果.表達(dá)有綠色熒光蛋白的E.coli ER2566在488 nm激發(fā)下，菌體呈現(xiàn)明亮的綠色熒光.從菌體在明場(chǎng)中的光學(xué)影像(圖4－A)和熒光掃描圖像(圖4－B)可見(jiàn)，所有大腸桿菌中均有綠色熒光蛋白表達(dá)，表明綠色熒光蛋白經(jīng)內(nèi)含肽介導(dǎo)的純化后具有正確的功能和良好的活性，可作為細(xì)胞的分子影像標(biāo)記.

圖4 含綠色熒光蛋白表達(dá)的E.coli ER2566共聚焦顯微鏡圖像Fig.4 Confocal image of E .coli ER2566 strains with GFP expression

3 結(jié)語(yǔ)

1)本研究利用內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪切反應(yīng)純化綠色熒光蛋白.在細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域中，綠色螢光蛋白經(jīng)常作為生物探針，是一種重要的標(biāo)記基因.其穩(wěn)定性好，顏色可見(jiàn)，易于檢測(cè).基于以上的優(yōu)點(diǎn)，本研究使用綠色熒光蛋白作為純化的目的蛋白.內(nèi)含肽催化的蛋白轉(zhuǎn)剪接反應(yīng)具有高效、反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)，在離體和活體條件下均能進(jìn)行蛋白質(zhì)的剪接反應(yīng).

2)Ssp DnaB內(nèi)含肽的剪切與溫度和pH值有很大關(guān)系.在pH 7.0，溫度16～23℃有較好的剪切活性.本研究利用單步反應(yīng)，采用20℃，pH 7.0條件下，誘導(dǎo)內(nèi)含肽自剪切活性的發(fā)生，從而純化目的蛋白.純化過(guò)程中無(wú)需添加任何其他試劑，系統(tǒng)中的作為親和標(biāo)簽的幾丁質(zhì)結(jié)合域仍留在親和柱上，得到的目的蛋白無(wú)親和標(biāo)簽，減少了親和標(biāo)簽對(duì)于蛋白質(zhì)的影響.

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