張 亮，杜曉寧，李良君

（上?；ぱ芯吭?上海穩(wěn)定同位素工程技術(shù)研究中心，上海 200062）

隨著后基因組計(jì)劃的到來，蛋白質(zhì)組研究成為生命科學(xué)的最前沿。在用核磁共振（NMR）研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及定量蛋白質(zhì)組學(xué)方面，13C標(biāo)記的氨基酸和蛋白質(zhì)都大有用武之地，已成為蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域不可或缺的重要工具［1］。13C標(biāo)記L－亮氨酸產(chǎn)品在醫(yī)藥工業(yè)、生命科學(xué)、食品工業(yè)、分析測試等相關(guān)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，特別是在醫(yī)療領(lǐng)域，其作用越來越突出。近年來，國內(nèi)一些大醫(yī)院也已開始利用13C標(biāo)記L－亮氨酸對(duì)多種疾病進(jìn)行診斷、治療。如：北京協(xié)和醫(yī)院利用13C標(biāo)記的L－亮氨酸進(jìn)行呼氣實(shí)驗(yàn)［2］，以判斷氨基酸在腸道內(nèi)的吸收是否異常，是否患有蛋白質(zhì)吸收不良癥；還可以通過給予口服氨基酸判斷進(jìn)行營養(yǎng)學(xué)治療的可能性。天津第二醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院以13C標(biāo)記亮氨酸作為示蹤劑跟蹤蛋白質(zhì)代謝是否異常，以此作為判斷癌癥的依據(jù)之一［3］。利用13C標(biāo)記亮氨酸進(jìn)行醫(yī)學(xué)研究更是不勝枚舉，如手術(shù)前后采用靜脈輸入13C標(biāo)記亮氨酸的方法進(jìn)行蛋白動(dòng)力學(xué)研究［4］，以亮氨酸－13C作為示蹤劑測定兔子燒傷后整體蛋白代謝水平的改變［5］等。而這些13C標(biāo)記L－亮氨酸試劑均從國外進(jìn)口，昂貴價(jià)格。本工作擬通過生物發(fā)酵法，自行研制L－亮氨酸－U－13C6。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

SCS－24型巡回式自動(dòng)搖瓶機(jī)：上海市離心機(jī)械研究所提供；LS－B50L高壓蒸汽滅菌鍋：上海醫(yī)用核子儀器廠提供。

1.2 主要試劑

13C標(biāo)記葡萄糖：上?；ぱ芯吭鹤灾疲黄咸烟牵篈R級(jí)，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；H＋型732陽離子交換樹脂：上海樹脂廠。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)基配方（g／L）

活化斜面培養(yǎng)基：葡萄糖1g／L、蛋白胨10g／L、牛肉膏10g／L、酵母膏5g／L、NaCl 2.5 g／L、瓊脂條20g／L、pH7.0～7.2。在121℃下滅菌20min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖5g／L、蛋白胨10g／L、牛肉膏10g／L、酵母膏 5g／L、NaCl 2.5g／L、pH 7.0～7.2。在121℃下滅菌20min。

2.2 誘變選育

2.2.1 紫外誘變

取1環(huán)菌體，接種于液體完全培養(yǎng)基，在28℃下振蕩（100r／min）培養(yǎng)9～10h。用滅完菌的移液器取1mL培養(yǎng)液，用無菌生理鹽水稀釋10倍后均勻涂布于保藏平板上，放入紫外照射箱進(jìn)行誘變，誘變時(shí)間為30～100s。

2.2.2 DES誘變

取1環(huán)菌體，接種于種子培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)6h，取10mL菌液，離心、去上清夜，菌體用磷酸緩沖液洗滌2次，之后加入一定量磷酸緩沖液配成菌液。向菌液中加入0.2mL DES誘變劑，攪拌誘變30min。用硫代硫酸鈉溶液終止誘變。

2.2.3 紫外與DES復(fù)合誘變

將DES誘變完的菌體再進(jìn)行紫外誘變，誘變條件與2.2.1節(jié)及2.2.2節(jié)相同。

2.2.4 營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選

根據(jù)育種目標(biāo)，本工作要選出“Met－＋I(xiàn)le－”突變株，即挑選僅能在添加蛋氨酸和異亮氨酸的平板上生長的突變株［6，7］。

2.2.5 抗性菌株的篩選

選育抗性突變株，可以解除亮氨酸合成途徑上關(guān)鍵酶及限速酶的反饋抑制及反饋?zhàn)瓒糇饔?，進(jìn)一步提高產(chǎn)酸累積量。通過在活化培養(yǎng)基中加入不同濃度不同種類的抗性藥物制成抗性藥物平板，將誘變后的突變株接入其中，挑選能夠在高抗性藥物濃度下生長的菌株。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)

2.3.1 種子液培養(yǎng)［8］

取1環(huán)活化后的菌體接入裝有25mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，9層紗布封口，30℃下，于巡回式搖瓶柜中培養(yǎng)15h，振搖速度為200r／min。

2.3.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)［9］

用移液槍取3mL上述培養(yǎng)好的種子液接入裝有20mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，9層紗布封口，28℃下于巡回式搖瓶柜中培養(yǎng)，振搖速度為200r／min。培養(yǎng)期間定其檢測殘?zhí)?，?dāng)殘?zhí)窍陆档?%以下時(shí)，發(fā)酵反應(yīng)停止。

2.4 提取方法

采用離子交換（732陽離子樹脂）法進(jìn)行分離，通過氯化銨、氨水兩步洗脫法進(jìn)行分離［10］。

2.5 分析方法

采用氨基酸自動(dòng)分析儀［11］測定發(fā)酵液產(chǎn)酸量；采用凱氏定氮法測定L－亮氨酸純度；采用同位素質(zhì)譜儀測定13C豐度。

3 結(jié)果與討論

3.1 目的突變株TS151的誘變選育［12］

育種譜圖中各菌株的氨基酸積累情況列于表1。由表1可以看出，通過數(shù)次誘變選育，出發(fā)菌株ACTT39106逐漸帶上蛋氨酸缺陷（Met－ ）、異 亮 氨 酸 缺 陷 （Ile－ ）和 帶 磺 胺 胍（SGr）、α－氨基丁酸（α－ABr）、β－羥基亮氨酸（β－HLr）抗性標(biāo)記等5種遺傳標(biāo)記，產(chǎn)酸也從原來的幾乎沒有提高到18.2g／L，滿足了高豐度生產(chǎn)的需求。

3.2 目的突變株TS151的遺傳穩(wěn)定性檢測

將高產(chǎn)菌株TS139和TS151在完全液體培養(yǎng)基上連續(xù)搖瓶培養(yǎng)10代。取第10代菌液用平板劃線分離單菌落后轉(zhuǎn)接斜面［13］。取斜面培養(yǎng)物制成經(jīng)離心洗滌過的菌懸液。用濾紙片法驗(yàn)證缺陷型標(biāo)記［14］；各取0.2mL菌液均勻涂布在各個(gè)藥物平板表面。28℃恒溫培養(yǎng)72h，觀察濾紙片周圍和藥物平板上有無菌體生長及生長情況，結(jié)果列于表2。

表2數(shù)據(jù)表明：TS139和TS151兩株菌仍為雙缺陷；TS139在8g／L磺胺胍抗性平板、8 g／Lα－氨基丁酸抗性平板上，TS151在8g／Lα－氨基丁酸抗性平板、4g／Lβ－羥基亮氨酸抗性平板上，均長出大小一致的小菌落。對(duì)每株菌隨機(jī)挑取5個(gè)菌落的少量菌體涂片，用革蘭氏染色，光鏡下檢查。結(jié)果顯示，菌體形態(tài)與原始菌株ATCC39106的一致。

3.3 發(fā)酵工藝的優(yōu)化

3.3.1 發(fā)酵配方的優(yōu)化

1）不同氮源對(duì)L－亮氨酸發(fā)酵的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別以硫酸銨、醋酸銨、尿素、硝酸銨和氯化銨（以硫酸銨用量為4%時(shí)的含氮量0.85g來計(jì)算其它氮源的添加量）為氮源培養(yǎng)36h，觀察氮源對(duì)發(fā)酵的影響，結(jié)果列于表3。從表3可以看出，以醋酸銨為氮源時(shí)L－亮氨酸產(chǎn)量最高，其次為硫酸銨。醋酸銨在發(fā)酵中不僅起著氮源的作用，同時(shí)其醋酸根離子也參與了亮氨酸的合成代謝。

表1 育種譜圖中各菌株的氨基酸積累情況

表2 遺傳標(biāo)記穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

表3 不同氮源對(duì)L－亮氨酸發(fā)酵的影響

2）醋酸銨與硫酸銨配比對(duì)發(fā)酵的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，醋酸銨與硫酸銨的配比對(duì)發(fā)酵的影響列于表4。從表4可以看出，表中所列各種配比，都能滿足菌體生長需要，但對(duì)產(chǎn)酸有不同的影響。當(dāng)有20g／L醋酸銨時(shí)，添加20g／L硫酸銨，可以提高L－亮氨酸產(chǎn)量；只添加硫酸銨，含量即使高達(dá)40g／L，L－亮氨酸產(chǎn)量仍較低。

表4 醋酸銨與硫酸銨配比對(duì)L－亮氨酸發(fā)酵的影響

3）生物素對(duì)發(fā)酵的影響

為了研究生物素用量對(duì)L－亮氨酸發(fā)酵的影響，實(shí)驗(yàn)在不添加玉米漿（玉米漿中含生物素）的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果示于圖1。由圖1可知，生物素對(duì)L－亮氨酸發(fā)酵的影響很顯著。生物素缺乏，菌體就不能生長；而當(dāng)生物素的質(zhì)量濃度提高到50～75μg／L時(shí)，菌體生長良好，可獲得較高的L－亮氨酸產(chǎn)量。

圖1 生物素對(duì)L－亮氨酸發(fā)酵的影響

4）碳酸鈣用量對(duì)發(fā)酵的影響

碳酸鈣用量對(duì)發(fā)酵的影響結(jié)果示于圖2。從圖2可知，碳酸鈣添加量為30g／L對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸最有利。

3.3.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1）溫度對(duì)發(fā)酵的影響

圖2 碳酸鈣用量對(duì)發(fā)酵的影響

溫度對(duì)發(fā)酵的影響示于圖3。由圖3可知，在28～30℃時(shí)，菌體生長好、菌體濃度大，L－亮氨酸產(chǎn)量較高，尤以28℃最好，發(fā)酵產(chǎn)酸達(dá)到最大值18.53g／L。溫度太低則菌體生長緩慢，難以完成對(duì)原料的轉(zhuǎn)化；溫度太高，菌體易衰老，菌體后勁不足，不利于高產(chǎn)L－亮氨酸。從圖3數(shù)據(jù)來看，L－亮氨酸發(fā)酵溫度控制在28℃為佳，最高不宜超過30℃。

2）裝液量對(duì)發(fā)酵的影響

采用優(yōu)化的培養(yǎng)基和相同的種子及接種比例，在同一搖床上，選擇培養(yǎng)溫度為28℃，在220r／min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)92h，考查250和500mL兩種規(guī)格圓底三角瓶的不同裝液量對(duì)L－亮氨酸發(fā)酵的影響，結(jié)果分別示于圖4和圖5。

圖3 溫度對(duì)L－亮氨酸發(fā)酵的影響

圖4 250mL三角瓶裝液量對(duì)L－亮氨酸發(fā)酵的影響

圖5 500mL三角瓶裝液量對(duì)L－亮氨酸發(fā)酵的影響

分析圖4和圖5可知，對(duì)相同規(guī)格三角瓶而言，由于固定了搖床轉(zhuǎn)速，若裝液量太少，在往復(fù)振蕩時(shí)發(fā)酵液翻滾過于劇烈，使溶氧過大而導(dǎo)致產(chǎn)酸不高。而裝液量過大則發(fā)酵液不易翻滾，使溶氧太少，導(dǎo)致產(chǎn)酸也不高。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，500mL三角瓶裝液50mL或250mL三角瓶裝液25mL為佳。

3）pH對(duì)發(fā)酵的影響

在接種前用滅菌的5mol／L NaOH溶液重調(diào)發(fā)酵液pH，并在發(fā)酵過程中每隔4h調(diào)pH至所需值（±0.1）。實(shí)驗(yàn)在同一搖床上進(jìn)行，發(fā)酵92h結(jié)束，結(jié)果示于圖6。由圖6得知，在發(fā)酵過程中控制pH7.0，有利于菌體生長和發(fā)酵產(chǎn)酸。實(shí)驗(yàn)中觀測到，pH對(duì)發(fā)酵前期的菌體生長和中、后期發(fā)酵產(chǎn)酸影響都較大。pH7.0時(shí)菌體生長較快，培養(yǎng)至36～38h即結(jié)束對(duì)數(shù)生長進(jìn)入穩(wěn)定期。因此，發(fā)酵過程控制pH7.0，有利于菌體生長和發(fā)酵產(chǎn)酸。

圖6 pH對(duì)L－亮氨酸發(fā)酵的影響

3.4 同位素13C高豐度實(shí)驗(yàn)

將黃色短桿菌TS151從斜面接種于種子培養(yǎng)基中，每瓶接1環(huán)菌體，共接2瓶，置于搖床上，在28℃、220r／min下震蕩培養(yǎng)20h。在無菌條件下按10%接種量將新鮮種子液接入發(fā)酵培養(yǎng) 基 中 （原 料 葡 萄 糖－13C 豐 度 為 99%），500mL三角瓶裝液量50mL，置于巡回式搖床上，在28℃、220r／min下培養(yǎng)92h，直到發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵平均產(chǎn)酸16.6g／L。

將上述發(fā)酵液合并后用草酸調(diào)節(jié)pH至2～3，經(jīng)離心分離（4 800r／min，30min），所得到的上清液用陽離子交換樹脂（H＋型）吸附。先用蒸餾水洗至中性，然后用0.2mol／L氯化銨溶液進(jìn)行洗脫，收集L－亮氨酸－U－13C6單斑洗脫液；將上述洗脫液調(diào)pH至2.0后上陽離子交換樹脂（H＋型）脫鹽；收集L－亮氨酸－U－13C6單斑洗脫液，放入活性炭脫色、結(jié)晶。真空干燥得到L－亮氨酸－U－13C6產(chǎn)品，產(chǎn)品豐度達(dá)97.03%，純度98.5%，提取收率71.31%。

4 小 結(jié)

1）本研究以代謝控制發(fā)酵原理為基礎(chǔ)，選育獲得突變株黃色短桿菌TS151（帶有5種遺傳標(biāo)記：Met－、Ile－、SGr、а－ABr、β－HLr），斜面連續(xù)轉(zhuǎn)接10次，遺傳標(biāo)記穩(wěn)定，高豐度產(chǎn)酸穩(wěn)定在15g／L以上，空白產(chǎn)酸穩(wěn)定在20g／L以上。

2）優(yōu)化了L－亮氨酸－U－13C6生產(chǎn)的發(fā)酵配方和發(fā)酵工藝，通過高豐度實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)選育菌株TS151可應(yīng)用于L－亮氨酸－U－13C6的生產(chǎn)。

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