楊麗萍，蒙子寧，劉曉春，張 勇，黃俊海，黃 景，林浩然, 4

(1.中山大學(xué)水生經(jīng)濟(jì)動物研究所∥廣東省水生經(jīng)濟(jì)動物良種繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510275；2. 西南林業(yè)大學(xué)云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；3. 珠海金鯢野生動物養(yǎng)殖有限公司，廣東 珠海 519015；4. 海南大學(xué)海洋學(xué)院, 海南 ?？?570228)

中國大鯢Andriasdavidianus隸屬于兩棲綱Amphibia，有尾目Caudata，隱鰓鯢科Cryptobrachidae，大鯢屬Andrias，是中國特有的珍稀瀕危物種，廣泛分布于長江、黃河及珠江中下游支流中，遍及華中、華南和西南等17個(gè)省區(qū)[5]。中國大鯢具有終身水棲的生理特性，因而難以越過陸地遷徙，其遺傳分化很可能與流域分布相關(guān)聯(lián)。然而，近期報(bào)道卻顯示二者之間關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)[6-8]。這些研究主要使用了線粒體編碼基因序列和同工酶方法，所分析的樣品總數(shù)在13-28尾。樣品數(shù)目偏少很可能無法反應(yīng)物種真實(shí)的遺傳結(jié)構(gòu)，因此有必要采用新方法，擴(kuò)大樣品量進(jìn)一步進(jìn)行中國大鯢遺傳分化與系統(tǒng)地理學(xué)的研究。

新型分子標(biāo)記AFLP，融合了RFLP的可重復(fù)性和RAPD的簡便性，具有信息量大、靈敏度高、多態(tài)性豐富和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[9]。早期AFLP分析主要應(yīng)用于植物領(lǐng)域[10]，隨后逐步拓展到動物領(lǐng)域，目前已廣泛應(yīng)用于黑真螈Salamandraatra、日本大鯢A.japonicus和草莓箭毒蛙Dendrobatespumilio等兩棲類遺傳結(jié)構(gòu)分析及保護(hù)遺傳學(xué)研究[11-13]。

本研究擬利用AFLP技術(shù)進(jìn)一步分析中國大鯢五個(gè)地理種群遺傳多樣性和遺傳分化，并聯(lián)系相關(guān)歷史地理事件，對中國大鯢種群的遺傳結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其歷史成因進(jìn)行探討，旨在獲得中國大鯢種群的遺傳多樣性資料，以及遺傳分化與環(huán)境間的相互關(guān)系，為合理利用大鯢種質(zhì)資源提供遺傳背景資料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及DNA提取

中國大鯢各地理種群樣品由珠海斗門金鯢水產(chǎn)科技有限公司在各原產(chǎn)地獲得，采樣地及所屬流域見表1和圖1，包括5個(gè)種群共60個(gè)個(gè)體。剪取尾部少量肌肉組織，置于液氮保存，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后放入-80 ℃超低溫冰柜備用。

取出保存?zhèn)溆玫拇篥F肌肉樣品，剪取約50 mg組織，采用常規(guī)酚-氯仿抽提法提取基因組DNA。w=0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，Eppendorf分光光度計(jì)測定DNA純度與濃度。

1.2 AFLP擴(kuò)增及數(shù)據(jù)分析

AFLP擴(kuò)增參照Vos等[14]所報(bào)道的方法并做略微改動?；蚪MDNA用EcoRI和MseI 37 ℃雙酶切10 h，加入接頭混合物后于22 ℃過夜。用帶有1個(gè)選擇性堿基的引物(E-A，M-C)進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。少量預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物用于電泳檢測，剩余樣品經(jīng)滅菌水稀釋10倍后作為選擇性擴(kuò)增模板。使用帶有3個(gè)選擇性堿基的引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)増。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)w=4.5% 變性聚丙稀酰胺凝膠分離后，通過銀染法顯帶。以擴(kuò)增條帶數(shù)目適中、分布均一和多態(tài)性高為標(biāo)準(zhǔn)，從96對引物組合中篩選出9對引物組合(E-AAC/M-CGT、E-ACA/M-CAC、E-ACT/M-CGA、E-ATC/M-CGA、E-ATC/M-CTT、E-ATG/M-CGT、E-ATG/M-CGA、E-ACA/M-CGA和E-AGA/M-CGA)用于本研究。AFLP操作流程中所用藥品均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(Shanghai Sangon)，PCR儀為PTC-200擴(kuò)增儀(Bio-RAD)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

電泳圖譜中的每條DNA譜帶記為一個(gè)位點(diǎn)，只記錄電泳后可辨認(rèn)的條帶。當(dāng)某一擴(kuò)增帶出現(xiàn)時(shí)記為1，缺失記為0，從而建立原始譜帶矩陣。

利用種群遺傳學(xué)軟件POPGENE1.32對“1/0” 矩陣進(jìn)行處理，統(tǒng)計(jì)多態(tài)位點(diǎn)百分率、基因多樣性和香農(nóng)信息指數(shù)等遺傳參數(shù)，評估中國大鯢五個(gè)地理種群的遺傳多樣性水平。

通過WINAMOVA v 1.55軟件，依據(jù)AMOVA(analysis of molecular variance)方法計(jì)算居群內(nèi)和居群間的遺傳變異、Fst類似物Phist(Фst)和遺傳距離。通過MEGA 3.1軟件對種群間遺傳距離構(gòu)建UPGMA系統(tǒng)進(jìn)化樹。

要想幫助學(xué)生順利渡過小學(xué)、初中階段的英語學(xué)習(xí)銜接，首先教師需要梳理兩個(gè)階段英語學(xué)習(xí)和學(xué)生心理的區(qū)別，以便做到有的放矢，針對性的做出準(zhǔn)備，解決學(xué)生面臨的困境。

表1 采樣點(diǎn)及樣本信息

圖1 中國大鯢種群樣品的采樣地(黑色圓點(diǎn)表示)

2 結(jié) 果

2.1 遺傳多樣性

9對引物在中國大鯢5個(gè)種群60個(gè)樣品中共檢測到507個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為354個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)比例為69.82%，片段大小在100～1 300 bp之間。圖2列舉了E-ATG/M-CGA引物組合對各地理種群進(jìn)行AFLP擴(kuò)增的電泳圖結(jié)果。中國大鯢5個(gè)種群總的多態(tài)位點(diǎn)比例、香農(nóng)信息指數(shù)和基因多樣性指數(shù)分別為69.82%，0.362 9和0.241 4。其中5個(gè)地理種群的多態(tài)位點(diǎn)比例呈貴州>陜西>河南>四川>湖北的遞減(見表2)。貴州種群的香農(nóng)信息指數(shù)和基因多樣性指數(shù)最高，分別為0.281 1±0.013 8和0.194 6±0.009 7；湖北種群的香農(nóng)信息指數(shù)(0.226 6±0.013 3)和基因多樣性指數(shù)(0.156 3±0.009 3)最低，其變化趨勢與多態(tài)位點(diǎn)比例相同(見表2)。

圖2 引物組合E-ATG/M-CGA對中國大鯢5個(gè)種群AFLP擴(kuò)增的部分帶譜

表2 中國大鯢5個(gè)野生種群多態(tài)位點(diǎn)比例、香農(nóng)信息指數(shù)和基因多樣性指數(shù)

Table 2 Percent of polymorphic loci, Shannon information index and gene diversity within five nature populations ofA.davidianus

種群多態(tài)位點(diǎn)比例香農(nóng)信息指數(shù)基因多樣性指數(shù)河南 41.22%0.243 8±0.013 50.168 2±0.009 5四川40.63%0.245 7±0.013 50.170 0±0.009 5陜西 44.38%0.261 4±0.013 60.180 1±0.009 5湖北 37.67%0.226 6±0.013 30.156 3±0.009 3貴州 46.94%0.281 1±0.013 80.194 6±0.009 7總計(jì) 69.82%0.362 90.241 4

2.2 遺傳分化與遺傳距離

通過AMOVA方法對各種群遺傳變異進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，有97.94%的變異存在于種群內(nèi)，僅有2.06%的變異存在于種群間。AMOVA分析得到遺傳分化參數(shù)Фst 為 0.021(P<0.001)，顯示種群間遺傳分化較小。

種群間的遺傳距離分布于0.004 6～0.040 8(表3)。其中，貴州與四川種群之間遺傳距離最小，為0.004 6，而湖北與河南種群之間遺傳距離最大，達(dá)到0.040 8。

采用種群間遺傳距離構(gòu)建了UPGMA樹(見圖3)。系統(tǒng)樹主要分為兩大支，一支由黃河流域河南種群組成；另一支由長江流域四川、貴州、湖北和陜西種群組成，其中屬于長江中游段重要支流漢江水系的陜西和湖北兩個(gè)種群聚類，屬于長江上游段的四川種群和貴州種群聚類?；疽勒樟饔蜻M(jìn)行聚類。系統(tǒng)進(jìn)化樹中最早分出的是位于中國北部的河南種群；地處中國中部的湖北和陜西種群先于位于南部的貴州和四川種群分出。進(jìn)化地位的古老性關(guān)系體現(xiàn)為北部>中部>南部。

表3 中國大鯢5個(gè)野生種群間遺傳距離

圖3 基于種群間遺傳距離構(gòu)建的UPGMA樹

3 討 論

3.1 中國大鯢野生種群遺傳多樣性分析

從進(jìn)化觀點(diǎn)來看，中國大鯢是由3億6千萬年前古生代泥盆紀(jì)時(shí)期水生魚類演變而成的古老兩棲動物，對探討脊椎動物由水生到陸生的演變具有關(guān)鍵性的意義。為闡明中國大鯢的遺傳背景，本研究將中國大鯢與其近緣物種以及進(jìn)化歷程相近的物種進(jìn)行了遺傳多樣性的比較。

本研究AFLP分析得到的中國大鯢種群多態(tài)位點(diǎn)比例(P)為69.82%，基因多樣性指數(shù)(H)為0.241 4。中國大鯢的遺傳多樣性高于施氏巴鯢Liuashihi(H：0.154 0)[16]，但低于俄勒岡陸巨螈(H：0.309 4)和赤背蠑螈(H：0.246 0)[3-4]。上述兩種鯢類基因多樣性低于兩種蠑螈類相應(yīng)遺傳參數(shù)，從棲息生境來看，所比較的兩種鯢類為終身水棲，而兩種蠑螈類均為成體陸棲。Nevo等[17]在對兩棲類進(jìn)行等位酶分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，陸棲生物相比水棲生物具有更高的遺傳多樣性，這與陸棲生物具有相對較廣的生境寬度(niche breadth)和更高的生態(tài)穩(wěn)定性(ecological stability)等有關(guān)。此外，將中國大鯢與其進(jìn)化歷程相近的一些古老物種進(jìn)行比較，中國大鯢的遺傳多樣性均高于所比較的巴西蛇頸龜Hydromedusamaximiliani(P：37.00%)[18]、北美食鼠蛇Elapheobsoleta(P：35.00%)和揚(yáng)子鱷Alligatorsinensis(P：58.50%)[19-20]。遺傳多樣性參數(shù)均揭示中國大鯢遺傳多樣性較為豐富，這與其生活史特征及地理分布相一致。中國大鯢一般3～5齡性成熟，生活史長達(dá)100多年，較大的年齡結(jié)構(gòu)差異容易維持較高的遺傳多樣性水平[21]。此外，中國大鯢分布區(qū)域遍及中國17個(gè)省區(qū)，在暖溫帶、亞熱帶不同氣候條件下均有分布。分布區(qū)域較廣也是其遺傳多樣性較高的一個(gè)原因。遺傳多樣性是物種長期進(jìn)化的產(chǎn)物，與物種適應(yīng)能力、生存能力和進(jìn)化潛力密切相關(guān)。由此可見中國大鯢這一古老物種能夠歷經(jīng)幾億年自然環(huán)境和氣候的變化存活至今，與其具有較高的遺傳多樣性有一定的關(guān)系。

中國大鯢5個(gè)地理種群的多態(tài)位點(diǎn)比例由高到低依次為貴州(46.94%)>陜西(44.38%)>河南(41.22%)>四川(40.63%)>湖北(37.67%)。大鯢在上述5個(gè)取樣地均呈現(xiàn)集中分布。陜西省太白縣湑水河設(shè)立有國家級中國大鯢自然保護(hù)區(qū)，地理位置處于漢江上游，位于陜西漢中之上。貴州龍里所處的烏江水系上游也設(shè)有中國大鯢自然保護(hù)區(qū)。河南盧氏縣建有省級中國大鯢自然保護(hù)區(qū)。貴州、陜西和河南種群遺傳多樣性相對較高，可能與自然保護(hù)區(qū)對中國大鯢野生種群的保護(hù)效果較好有關(guān)。

大鯢的人工養(yǎng)殖于20世紀(jì)70年代開始在各地廣泛開展。養(yǎng)殖基地親本多來自野生種群，養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，可能會影響到野生種群遺傳結(jié)構(gòu)。湖北省十堰市房縣建有馴養(yǎng)規(guī)模在萬尾以上的中國大鯢養(yǎng)殖基地，為建立親本群體，當(dāng)?shù)匾吧N群可能經(jīng)歷過一次瓶頸效應(yīng)，造成遺傳多樣性水平較低。而在同樣建有大規(guī)模養(yǎng)殖基地的陜西省漢中，中國大鯢遺傳多樣性仍然維持在較高水平，這可能與當(dāng)?shù)匾吧N群遺傳多樣性自身水平較高有關(guān)。

3.2 遺傳結(jié)構(gòu)及種群分化

中國三大水系的發(fā)育形成具有上億年的歷史，其中長江與“黃河”分隔較早，在中生代侏羅紀(jì)末至白堊紀(jì)初，秦嶺山脈的上升，切斷長江與北方的聯(lián)系，經(jīng)歷燕山運(yùn)動后期后，長江全貌顯現(xiàn)[22]。長江與珠江的分離是在白堊紀(jì)末、第三紀(jì)初燕山運(yùn)動之南嶺期時(shí)成形[23]。黃河的形成時(shí)期最晚，在新生代第四紀(jì)，由于喜馬拉雅運(yùn)動，西部青藏高原地勢升高，原有的湖泊相連而成。盡管黃河形成比較晚，但早期已經(jīng)出現(xiàn)大量湖泊溪流[24]。遷徙力較差的古老物種在經(jīng)歷地理分隔事件后，物種群體間基因流被阻斷，隨著時(shí)間的積累而產(chǎn)生種內(nèi)差異，地理格局往往可以反映其遺傳關(guān)系。本研究中國大鯢種群的聚類情況大致依照所屬流域進(jìn)行，體現(xiàn)了與地理分布格局的統(tǒng)一性。種群聚類分析顯示中國大鯢依照長江流域和黃河流域分為兩大支。其中長江流域中屬于長江中游段重要支流漢江水系的陜西和湖北兩個(gè)種群聚類，屬于長江上游段的四川種群和貴州種群聚類。然而來自線粒體與同工酶方法的結(jié)果卻未得到聚類與流域一致[6-8]。Murphy等[6]采用線粒體與同工酶技術(shù)分析中國大鯢遺傳多樣性所用樣品量為18尾，陶峰勇等[7-8]利用Cyt b和控制區(qū)序列分析時(shí)分別用到13尾和28尾。而本研究樣品量達(dá)到60尾。樣品量多少可能會影響到種群間遺傳距離與聚類分析。此外，分析方法的差異可能會影響到結(jié)果，同工酶方法檢測的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)目有限，相比而言AFLP標(biāo)記可獲得豐富的多態(tài)位點(diǎn)。

AFLP分析得到的遺傳分化指數(shù)Фst僅為0.021，顯示分化較低。種群間AMOVA遺傳變異分析也顯示，在眾多變異中有97.94%存在于種群內(nèi)，僅有2.06%變異存在于種群間。遺傳距離結(jié)果也顯示中國大鯢不同地理種群間遺傳差異較小。中國大鯢自身遷徙力很差，除在自身流域內(nèi)活動外，在各流域之間遷徙較難，那么為什么中國大鯢種群間的遺傳分化如此小呢？分析中國大鯢的使用歷史，可以得出人為操作是主要誘因。對中國大鯢食用與藥用價(jià)值的認(rèn)識最早始于戰(zhàn)國時(shí)期，距今有近2 300 a歷史，在相互交流中可能有中國大鯢的移動發(fā)生。但由于古代交通閉塞，這種人為影響作用相對較弱。在20世紀(jì)50年代到80年代，人們對中國大鯢進(jìn)行了大規(guī)模捕殺販賣，其中存在個(gè)別個(gè)體在非原產(chǎn)地逃逸的現(xiàn)象；另外，對于被查獲而沒收的中國大鯢活體，國家相關(guān)管理部門通常采用就近放流，此操作直接將其它地理種群引入當(dāng)?shù)匾吧后w，造成極強(qiáng)的基因流效應(yīng)。此外，人工放流也是降低種群分化的一個(gè)重要原因。人工養(yǎng)殖鯢苗的親本往往來自于全國各主要產(chǎn)區(qū)的野生個(gè)體，放流操作一方面使得野外群體數(shù)量短期得到大量增加，另一方面也嚴(yán)重破壞了當(dāng)?shù)卦蟹N群的遺傳結(jié)構(gòu)。在2002-2009年期間，中國大鯢各原產(chǎn)地先后組織了多次大規(guī)模的人工放流。

依據(jù)種群間遺傳距離構(gòu)建的UPGMA樹得出位于中國北部的黃河流域群體處于樹的基部，顯示北部群體具有較為古老的進(jìn)化地位。其次分出的是位于中部的湖北、陜西種群，最后為南部貴州及四川種群。提示中國大鯢北部種群更為原始，其次為中部和南部種群。基于此推測，中國大鯢首先到達(dá)中國北部，并由此進(jìn)一步向中部及南部地區(qū)進(jìn)行擴(kuò)散(圖4)，即由河南→陜西、湖北→四川、貴州。這一推測得到了化石證據(jù)的進(jìn)一步支持。最早的現(xiàn)生蠑螈類化石發(fā)現(xiàn)于中國內(nèi)蒙古及河北地區(qū)，地質(zhì)年代為侏羅紀(jì)中期，其骨骼結(jié)構(gòu)以及形態(tài)發(fā)育與隱鰓鯢科相似性極高[25-26]。黃河流域是離中國內(nèi)蒙古及河北地區(qū)最近的區(qū)域，因而應(yīng)該是中國大鯢最先到達(dá)的地域，進(jìn)而由此擴(kuò)散到中南部地區(qū)。

圖4 推測中國大鯢擴(kuò)散途徑示意圖

中國大陸黑斑側(cè)褶蛙的擴(kuò)散途徑與本研究得出的中國大鯢的擴(kuò)散途徑一致，即由北向南進(jìn)行擴(kuò)散[27]，而楊玉慧等對中國黑斑蛙分析得出了由南至北的擴(kuò)散方式[28]。歷史上冰期與間冰期旋回引起的氣候波動及生境變化會影響到物種分布與擴(kuò)散。第四紀(jì)冰期對北美洲和歐洲影響較大，當(dāng)?shù)乇诤笪锓N普遍呈現(xiàn)由南向北的擴(kuò)散模式[29-30]。東亞由于受到青藏高原隆起及季風(fēng)氣候的影響，冰川發(fā)育程度和面積要比北美與歐洲弱。在冰期影響不嚴(yán)重的地域，不同物種由于自身生境條件、繁殖能力與擴(kuò)散能力的不同，其擴(kuò)散途徑可能存在差異。

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