丹酚酸D穩(wěn)定性研究

繆興龍， 靳元鵬， 張?zhí)m蘭， 周水平， 郭治昕*

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193;2.天津天士力集團(tuán)有限公司，天津300410)

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根及根莖，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩和滋補(bǔ)作用，在臨床上用于心腦血管疾病、癌癥、抗衰老等方面的治療［1］。丹參中的化學(xué)成分主要為脂溶性和水溶性?xún)深?lèi)，脂溶性成分主要為丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、隱丹參酮等;水溶性成分主要是酚酸類(lèi)，包括丹參素、原兒茶醛、原兒茶酸、咖啡酸、丹酚酸 A、丹酚酸 B、丹酚酸D、迷迭香酸等［2］。丹酚酸類(lèi)成分具有抗氧化、保護(hù)腦組織細(xì)胞損傷、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)的作用［3］。但由于丹酚酸類(lèi)成分不穩(wěn)定，導(dǎo)致一些以丹酚酸水溶性成分為主的丹參制劑在生產(chǎn)過(guò)程中成分容易發(fā)生變化，給制劑生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量控制帶來(lái)影響。文獻(xiàn)報(bào)道的此類(lèi)物質(zhì)的研究以丹酚酸B為主，丹酚酸B易受加熱溫度、加熱時(shí)間和pH影響而發(fā)生水解反應(yīng)［4］;丹酚酸B在一定條件可轉(zhuǎn)化為丹酚酸A，從而用于丹酚酸A的制備［5］。目前尚未見(jiàn)有關(guān)丹酚酸D(salvianolic acid D，SalD)的相關(guān)研究，因此本實(shí)驗(yàn)針對(duì)丹酚酸D的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，采用高效液相色譜測(cè)定不同影響因素下的峰面積變化，為制劑生產(chǎn)過(guò)程中的穩(wěn)定性控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù);同時(shí)觀察不同實(shí)驗(yàn)條件下其它一些丹酚酸類(lèi)成分的生成情況，了解丹酚酸D與其它丹酚酸成分間的轉(zhuǎn)化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 儀器 高效液相色譜儀(Agilent 1100，數(shù)據(jù)處理軟件為ChemStation);電熱恒溫水浴鍋(北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司);KQ-500DB型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);HI 9025 microcomputer pH meter(Hanna Instruments Pte Ltd);TC-10K型電子天平(常熟雙杰測(cè)試儀器廠);BUCHI Rotavapor R-200;BUCHI Heating Bath B-490;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);調(diào)溫電熱套(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。

1.2 材料、試劑 丹參藥材購(gòu)于陜西商洛GAP基地，經(jīng)天津天士力制藥股份有限公司鑒定為唇形科鼠尾草屬植物丹參的干燥根及根莖;AB-8樹(shù)脂(天津興南允能高分子技術(shù)有限公司);聚酰胺(臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠);MCI填料(日本三菱公司);色譜乙腈(Merck公司);濃鹽酸、磷酸、氫氧化鈉固體(分析純);蒸餾水(Milli-Q制備);丹參浸膏(天津天士力制藥股份有限公司生產(chǎn)車(chē)間提供)。

1.3 樣品制備 丹參浸膏適量水溶解，上AB-8樹(shù)脂柱，水洗脫得含丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸D的洗脫液;將上述洗脫液用濃鹽酸調(diào)節(jié)至pH=3，再次上AB-8樹(shù)脂柱，pH=3的酸水洗脫，除去丹參素及原兒茶醛，然后用95%乙醇溶液將迷迭香酸、丹酚酸D洗脫下來(lái);將95%乙醇洗脫液減壓濃縮后，上聚酰胺色譜柱，依次用30%、40%乙醇溶液洗脫，得到丹酚酸D溶液，減壓濃縮得丹酚酸D粗品;再將丹酚酸D粗品溶解，過(guò)MCI色譜柱，依次用10%、20%乙醇溶液洗脫，得丹酚酸D溶液，減壓濃縮得丹酚酸D樣品。

1.4 pH值對(duì)丹酚酸D穩(wěn)定性影響 丹酚酸D樣品40 mg用300 mL蒸餾水溶解，量取丹酚酸D水溶液4份，每份50 mL，分別用濃鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為1、3、5、7。將4份不同pH的丹酚酸D水溶液進(jìn)行加熱回流10 h，定時(shí)取樣檢測(cè)，以峰面積比表征丹酚酸D變化情況。

1.5 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液對(duì)丹酚酸D穩(wěn)定性影響 丹酚酸D樣品40 mg分別用300 mL的30%、60%、90%乙醇溶液溶解，各量取丹酚酸D溶液4份，每份50 mL，分別用濃鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為1、3、5、7。將4份不同 pH的丹酚酸 D不同濃度乙醇溶液進(jìn)行加熱回流10 h，定時(shí)取樣檢測(cè)，以峰面積比表征丹酚酸D變化情況。

1.6 溫度對(duì)丹酚酸D穩(wěn)定性影響 根據(jù)丹酚酸D在不同水-乙醇溶液中穩(wěn)定性影響研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)行丹酚酸D在不同溫度下穩(wěn)定性研究。丹酚酸D樣品40 mg用300 mL適宜溶液溶解，量取丹酚酸D溶液4份，每份50 mL，分別用濃鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為1、3、5、7。將4份不同pH的丹酚酸D溶液置于不同溫度下保存10 h，定時(shí)取樣檢測(cè)，以峰面積比表征丹酚酸D變化情況。

2 結(jié)果

2.1 色譜條件［6］色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18(5 μm，4.6 mm × 250 mm);流動(dòng)相 A:0.02% 磷酸水溶液，流動(dòng)相B:乙腈-0.02%磷酸水溶液(80∶20)，梯度洗脫(0 min，A:90%;0 ～8 min，A:90%→78%;8～15 min，A:78% →74%;15～55 min，A:74%→48%);體積流量1 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

此方法為復(fù)方丹參滴丸質(zhì)量控制方法的色譜條件，可同時(shí)檢測(cè)6種丹參水溶性成分:丹參素、原兒茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A。見(jiàn)圖1。

圖1 6種丹酚酸成分色譜圖Fig.1 The chromatogram of six salvianolic acid components

2.2 樣品測(cè)定 1.3項(xiàng)制備的丹酚酸D樣品進(jìn)行HPLC檢測(cè)，歸一化法計(jì)算丹酚酸D峰面積大于90%，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 丹酚酸D樣品色譜圖Fig.2 The chromatogram of salvianolic acid D sample

2.3 pH值對(duì)丹酚酸D穩(wěn)定性影響 結(jié)果見(jiàn)表1和圖3。

表1 調(diào)節(jié)pH及加熱回流10 h后變化情況Tab.1 The content changes after pH adjustment and refluence 10 hours

圖3 加熱回流10 h后成分變化情況Fig.3 The component changes after refluence 10 hours

調(diào)節(jié)丹酚酸D水溶液的 pH分別至1、3、5、7后，丹酚酸D峰面積基本保持不變。不同pH的丹酚酸D水溶液隨著加熱時(shí)間的增加，丹酚酸D的峰面積逐漸減少;不同pH的丹酚酸D水溶液加熱回流10 h后丹酚酸D均發(fā)生轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物有丹參素和原兒茶醛(在所用檢測(cè)條件下測(cè)得，以下相同)，丹酚酸D減少量越多，丹參素和原兒茶醛的轉(zhuǎn)化量越多。

由于丹酚酸類(lèi)成分具有酚羥基，使丹酚酸類(lèi)成分在堿性條件下極易成鹽，導(dǎo)致丹酚酸類(lèi)成分發(fā)生化學(xué)變化，因此本實(shí)驗(yàn)不對(duì)堿性條件下的丹酚酸D進(jìn)行研究。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)不同pH的丹酚酸D水溶液加熱后，丹酚酸D峰面積逐漸減少，溶液pH不同峰面積減少程度不同。pH為3～7的水溶液中丹酚酸D較pH=1的水溶液中穩(wěn)定，但隨著受熱時(shí)間的增加，其峰面積不斷減少;因丹酚酸D為弱酸性成分，故在弱酸性條件下相對(duì)穩(wěn)定。丹酚酸D峰面積不斷減少可能是由于高溫及H+催化使丹酚酸D發(fā)生轉(zhuǎn)化。丹酚酸類(lèi)成分大部分為咖啡酸的聚合物［7］，其中丹參素為咖啡酸的單體化合物，丹酚酸D為咖啡酸的二聚物，丹酚酸D結(jié)構(gòu)中含有酚羥基、酯鍵及羧基，溶液在加熱過(guò)程中丹酚酸D容易發(fā)生分解及被氧化，使丹酚酸D發(fā)生轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化為其它小分子的物質(zhì)如丹參素和原兒茶醛等。隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)丹酚酸D量逐漸減少，丹參素和原兒茶醛的峰面積逐漸增加，與文獻(xiàn)中報(bào)道的丹參素、原兒茶醛量隨著丹參藥材提取液的受熱時(shí)間延長(zhǎng)量持續(xù)增加具有一定的相似性［8-10］?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4。

圖4 丹酚酸D，丹參素，原兒茶醛化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.4 The chemical structure of SalD，DSS，PA

2.4 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液對(duì)丹酚酸D穩(wěn)定性影響 結(jié)果見(jiàn)表2和圖5、6、7。

表2 不同溶液中加熱回流10 h后變化情況Tab.2 The content changes in different solvents after refluence 10 hours

丹酚酸D在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液中加熱回流后峰面積均有不同程度減少:pH=1的4種溶液中丹酚酸D均不穩(wěn)定，變化較大;pH=3，丹酚酸D在水溶液、30%乙醇溶液及60%乙醇溶液中較90%乙醇溶液中穩(wěn)定，但仍有部分發(fā)生轉(zhuǎn)化;pH=5的4種溶液中丹酚酸D穩(wěn)定性差異不大，較為穩(wěn)定;pH=7，丹酚酸D在30%、60%乙醇溶液中較其他2種溶液中穩(wěn)定。

圖5 30%乙醇溶液中加熱回流10 h后成分變化情況Fig.5 The component changes in 30%EtOH solution after refluence 10 hours

圖6 60%乙醇溶液中加熱回流10 h后成分變化情況Fig.6 The component changes in 60%EtOH solution after refluence 10 hours

圖7 90%乙醇溶液中加熱回流10 h后成分變化情況Fig.7 The component changes in 90%EtOH solution after refluence 10 hours

不同溶液中的轉(zhuǎn)化關(guān)系:在水溶液中主要轉(zhuǎn)化為丹參素、原兒茶醛;在乙醇溶液中可轉(zhuǎn)化為丹酚酸A、丹酚酸B，且乙醇的體積分?jǐn)?shù)越大轉(zhuǎn)化的丹酚酸A和丹酚酸B越多。丹酚酸D在水溶液中可能是其自身發(fā)生降解轉(zhuǎn)化生成丹參素和原兒茶醛;而丹酚酸D在乙醇溶液中可能發(fā)生降解和縮合反應(yīng)，生成丹酚酸A和丹酚酸B。丹酚酸A為咖啡酸的三聚物，由一分子丹參素和兩分子咖啡酸縮合而成，丹酚酸B為咖啡酸的四聚物，由三分子丹參素和一分子咖啡酸縮合而成。丹酚酸A、B可能的生成途徑:①丹酚酸D與丹酚酸D轉(zhuǎn)化得到的丹參素和原兒茶醛縮合而成;②丹酚酸D的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物丹參素和原兒茶醛等小分子成分縮合而成;③ 另外，丹酚酸B還可由兩分子丹酚酸D縮合而成。化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖8。

圖8 丹酚酸A，丹酚酸B化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.8 The chemical structures of SalA，SalB

2.5 溫度對(duì)丹酚酸D穩(wěn)定性影響 結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同溫度10 h后變化情況Tab.3 The content changes in different temperatures after 10 hours

丹酚酸D在低溫條件下穩(wěn)定，峰面積變化較小，隨著溫度的升高丹酚酸D的峰面積逐漸減少;溫度越高，丹酚酸D峰面積變化越大。

3 討論

丹酚酸D在弱酸性條件下相對(duì)穩(wěn)定;不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液對(duì)丹酚酸D的穩(wěn)定性影響較小;低溫條件下丹酚酸D穩(wěn)定，隨著溶液加熱溫度的升高丹酚酸D峰面積逐漸減少，發(fā)生轉(zhuǎn)化。丹酚酸D在水溶液中可轉(zhuǎn)化為丹參素和原兒茶醛，在乙醇溶液中可轉(zhuǎn)化為丹酚酸A、丹酚酸B。

丹酚酸D水溶液在高溫強(qiáng)酸(pH=1)條件下有利于丹參素轉(zhuǎn)化;丹酚酸D 90%乙醇溶液在高溫弱酸(pH值為3～7)條件下有利于丹酚酸A、丹酚酸B的轉(zhuǎn)化。丹酚酸D在水溶液和乙醇溶液中轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物不同，說(shuō)明丹酚酸D在水和乙醇溶液中的轉(zhuǎn)化途徑存在一定的差異。

在制劑生產(chǎn)過(guò)程中丹酚酸D溶液應(yīng)處在低溫及弱酸的條件下，以防止丹酚酸D發(fā)生轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致成分量減少。

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