球形紅細(xì)菌生物轉(zhuǎn)化槲寄生中總?cè)祁惢衔锏臏y定

侯曉峰 ，鄭慶紅 ，漆小梅 ，楊官娥 *，張肇銘

1.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西太原 030001；2.山西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西太原 030006

槲寄生為桑寄生科槲寄生屬植物V.coloratum（Komar.）Nakai的干燥帶葉莖枝，具有祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎作用[1]。其中含有黃酮類、生物堿類、三萜類、多肽等化合物。球形紅細(xì)菌為光合細(xì)菌中的一種，為一種有益菌，可以轉(zhuǎn)化中藥中的部分成分[2-3]。本課題組通過一定工藝制得球形紅細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生培養(yǎng)液（PSBT），提高了槲寄生的抗腫瘤活性，降低了其毒性。通過系統(tǒng)分離、細(xì)胞毒活性篩選表明，三萜類化合物為其中細(xì)胞毒活性的有效部位之一[4]。本文建立槲寄生及球形紅細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生培養(yǎng)液中總?cè)祁惢衔锏暮繙y定方法，并對槲寄生及PSBT中各含量進(jìn)行比較研究，為球形紅細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生化學(xué)成分和轉(zhuǎn)化機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 藥材

由亳州市中藥飲片廠加工，東北產(chǎn)地，并經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥學(xué)教研室高建平教授鑒定為桑寄生科槲寄生屬植物槲寄生[V.coloratum（Kom.）Nakai]。藥材標(biāo)本保存于山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥學(xué)教研室。

1.2 培養(yǎng)基[5]

1.3 菌種

紫色非硫菌群紅細(xì)菌屬的球形紅細(xì)菌（rhodobacter sphaeroides），由山西大學(xué)光合細(xì)菌研究室分離鑒定保藏，菌液含菌數(shù) 8.0×108個(gè)/ml。

1.4 主要儀器及試劑

UV 2802型紫外可見分光光度計(jì)（美國尤尼柯）；齊墩果酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110709-200304），其他試劑均為分析純。槲寄生各提取物及各轉(zhuǎn)化液樣品，見表1。

表1 槲寄生各提取物及各轉(zhuǎn)化液樣品表

2 方法與結(jié)果

2.1 固定化球形紅細(xì)菌的制備

將已培養(yǎng)好的球形紅細(xì)菌培養(yǎng)液在5000 r/min下離心30 min，菌體用生理鹽水洗滌2次，收集濕菌體。將終濃度為10%（g/g）的聚乙烯醇（PVA）加水加熱溶解，冷卻到 35℃，加入終濃度為30%（g/g）的濕菌體，攪勻，注射器滴入pH值為6.5（用NaOH調(diào)節(jié)）的飽和硼酸水溶液中形成直徑為3 mm左右的固定化球形紅細(xì)菌細(xì)胞，將形成的小球放入4℃冰箱中固定化18 h，蒸餾水洗滌3次，培養(yǎng)液中活化24 h，待用[4]。

2.2 三萜類化合物的測定及對比研究[5-9]

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取齊墩果酸對照品20 mg，置于100 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.2 mg/ml的齊墩果酸對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制 取10 ml待測樣品溶液，減壓蒸干，加乙醚適量回流提取至提取液無色，揮干溶劑，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。因樣品中總?cè)坪肯嗖詈艽螅绻辉诰€性范圍內(nèi)，做適當(dāng)稀釋后測定。

2.2.3 最大吸收波長的確定 分別取經(jīng)顯色后的對照品及供試品溶液，在200～800 nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明，樣品、對照品均在535 nm處有最大吸收，故選擇535 nm作為測定波長。

2.2.4 專屬性試驗(yàn) 取經(jīng)顯色后的常規(guī)光合細(xì)菌培養(yǎng)基（即陰性對照，按“1.2”項(xiàng)下方法配制），在 200～700 nm 范圍內(nèi)掃描。結(jié)果在535 nm處沒有吸收，說明選擇535 nm作為測定波長，陰性對照無干擾。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍的考察 精密吸取上述對照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml，分別置具塞的試管中，揮去溶劑，準(zhǔn)確加入5%的香草醛-冰醋酸溶液和1.00 ml高氯酸，混勻，在60℃恒溫水浴中加熱15 min，冰水浴中冷卻至室溫，加入5.00 ml的冰乙酸，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻（濃度用C表示），在535 nm處測定吸光度（A）。線性方程為A=21.988C-0.072，相關(guān)系數(shù)r=0.9895，線性范圍為 2～12 μg。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取對照品溶液0.4 ml，按“2.2.5”項(xiàng)下方法顯色，連續(xù)測定5次，測得含量的RSD=1.13%，表明分析方法精密度良好。

2.2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批樣品5份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，按“2.2.5”項(xiàng)下方法測定，測得含量的RSD=3.12%，表明分析方法重現(xiàn)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取經(jīng)顯色后的供試品溶液，在1 h內(nèi)每隔10 min測吸光度1次，30 min內(nèi)測得含量的RSD=3.65%，以后吸光度相差很大，故測定應(yīng)該在顯色后30 min內(nèi)測定。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知總?cè)坪康呐囵B(yǎng)液5 ml，分別加入對照品溶液 3、5、7 ml。按“2.2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，按“2.2.5”項(xiàng)下方法測定，計(jì)算回收率。見表2。

表2 回收率測定結(jié)果（n=3）

2.2.10 樣品含量測定及比較 取樣品溶液分別制備供試品溶液，在535 nm處測定吸光度，如超出線性范圍，稀釋至適當(dāng)倍數(shù)測定，表1中1～9號(hào)樣品總?cè)祁惡?（n=3）分別為1.80、0.22、4.34、4.44、2.10、0.22、0.18、0.24、0.01 mg/ml。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，槲寄生水提取液（樣品2）及槲寄生水提取液的球形紅細(xì)菌轉(zhuǎn)化液（樣品6、7、8），其總?cè)坪慷己艿?，說明水不能將槲寄生藥材中的三萜類提取完全；75%的乙醇提取、半量常規(guī)培養(yǎng)基、游離球形紅細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)，所得培養(yǎng)液（樣品3）總?cè)坪亢烷渭纳?5%的乙醇提取液（樣品1）相比增加141%，說明經(jīng)過球形紅細(xì)菌轉(zhuǎn)化可以增加槲寄生提取液中的總?cè)频暮浚粯悠?和樣品3相比，總?cè)坪可杂性黾?，說明固定化球形紅細(xì)菌在一定條件下有利于樣品中總?cè)祁惢衔锏霓D(zhuǎn)化，但球形紅細(xì)菌固定化后不適合藥用，需要進(jìn)一步考慮；另外，樣品4和樣品5中總?cè)坪肯啾仍黾?11%，說明培養(yǎng)液中不添加常規(guī)培養(yǎng)基，適合固定化球形紅細(xì)菌對槲寄生藥材中三萜類化合物的轉(zhuǎn)化，使總?cè)频暮吭黾?。由此可見，在不同的條件下，對各種類型化合物的最佳轉(zhuǎn)化條件是不同的，也體現(xiàn)了中藥全成分生物轉(zhuǎn)化的復(fù)雜性。本文建立槲寄生及球形紅細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生培養(yǎng)液中總?cè)祁惢衔锏暮繙y定方法，并對槲寄生及PSBT中各含量進(jìn)行比較研究。為球形紅細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生化學(xué)成分和轉(zhuǎn)化機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

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