吳 峻，鄭 婷，童珊珊，李鈺青，佘曉芬，張 萌，肖 云

(廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510120)

研究表明，各種損傷因子(如血壓、血脂等)可促使血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)分化、增殖并遷移形成新的內(nèi)膜，這種增殖效應(yīng)在動脈硬化、血管成形術(shù)后再狹窄發(fā)生機(jī)制中起著重要作用［1］。血小板源性生長因子(plateletderived growth factor，PDGF)是影響血管內(nèi)皮的常見炎癥因子之一，它有不同的單聚體或多聚體(如PDGF－AA、－BB、－CC等)，可通過不同的受體對不同組織產(chǎn)生不同的效應(yīng)。PDGF在動脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)制中的作用除了損傷血管內(nèi)皮外，也可能通過促進(jìn)VSMCs增殖來實(shí)現(xiàn)，其詳盡機(jī)制仍在探索中［2，3］。一磷酸腺苷激活的蛋白激酶 (AMP－activated protein kinase，AMPK)是細(xì)胞能量代謝的調(diào)節(jié)因子，還可能參與細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并導(dǎo)致細(xì)胞在分裂增殖周期中停滯，從而抑制細(xì)胞的增殖［4］。目前有關(guān)PDGF和AMPK影響VSMCs的詳盡機(jī)制尚未明了，本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用AMPK激活劑5－氨基咪唑－4－甲酰胺核糖核苷(5－aminoimidazole－4 －carboxamide－1－β－D－riboside，AICAR)及 PDGF干預(yù)VSMCs，初步觀察其作用下VSMCs的增殖變化;并通過檢測AMPK活性對哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)表達(dá)強(qiáng)度的影響，探討AMPK活化影響VSMCs增殖的可能途徑。

材料和方法

1 試劑

胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(HyClone);DMEM培養(yǎng)基、1×青霉素－鏈霉素、胰蛋白酶(Gibco);二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)(Sigma);血小板衍生生長因子－BB(platelet－derived growth factor－BB，PDGF－BB)(Peprotech);AICAR(TRC);p－AMPK抗體(CST);p－mTOR抗體(Bioworld);αactin平滑肌細(xì)胞檢測試劑盒(博士德公司);精準(zhǔn)定量DNA marker(Trans);RT－PCR試劑盒(TaKaRa);全蛋白提取試劑盒(凱基公司)。儀器:低溫冷凍離心機(jī)(Hettich)，SM－F123制冰機(jī)(Sanyo)，恒壓恒流電泳儀DYY－III2(北京六一設(shè)備廠)，低溫冰箱(Forma Scientific)，VCX750型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(Sonic)，核酸定量儀(Eppendorf)，PCR擴(kuò)增儀(Biometra)，Sunrise酶標(biāo)儀(Tecan)，電泳及轉(zhuǎn)膜裝置(Bio－Rad)，凝膠成像及圖像分析系統(tǒng)分析(中國上海天能)。

2 VSMCs的培養(yǎng)

雄性SD大鼠購自廣東實(shí)驗(yàn)動物中心(粵監(jiān)證字2008A002)，體重200－300 g，戊巴比妥麻醉后引臼處死，無菌狀態(tài)取出胸主動脈，采用組織塊貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)，傳代篩選后用α－actin平滑肌細(xì)胞檢測試劑盒鑒定細(xì)胞，所有實(shí)驗(yàn)均采用4～6代細(xì)胞。

3 細(xì)胞增殖檢測(MTT法)

取第4代VSMCs以2.5×104接種到96孔板貼壁24 h，饑餓24 h后更換10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基并加入0.5 mmol/L AICAR，PDGF－BB干預(yù)濃度為 10 μg/L，分為:A 組(AICAR)、P 組(PDGF)、A+P組(AICAR+PDGF)和對照組4個(gè)組，每組6個(gè)復(fù)孔，每作用24 h、48 h及72 h前30 min加入MTT 試劑(5 g/L，20 μL)，終點(diǎn)時(shí)間加入 200 μL DMSO溶解顆粒，酶標(biāo)儀在570 nm處記錄數(shù)值，每組5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

4 蛋白活性檢測(Western blotting)

4.1 p－AMPK表達(dá)檢測 取第4代VSMCs以4×104接種到50 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿貼壁24 h，饑餓24 h后更換10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基并加入AICAR 其終濃度0.5 mmol/L。分別在30 min、1 h、3 h、6 h、12h采用凱基全蛋白提取試劑盒，抽提細(xì)胞總蛋白，取20 μg以4% ～12%的十二烷基硫酸鈉－聚丙酰胺凝膠(SDS－PAGE，Invitrogen)電泳分離，轉(zhuǎn)膜后，5%BSA的TBST封閉過夜，Ⅰ抗4℃孵育2 h，Ⅱ抗室溫1 h，ECL試劑盒顯帶分析并測灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次;另取第4代VSMCs以4×104接種到50 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿貼壁24 h，饑餓24 h后更換10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基并按不同組加入AICAR濃度0.5 mmol/L，PDGF －BB 濃度10 μg/L，分為:A 組(AICAR)、P組(PDGF)、A+P 組(AICAR+PDGF)和對照組4個(gè)組，每組6個(gè)復(fù)孔，在12 h采用凱基全蛋白提取試劑盒抽提細(xì)胞總蛋白，按上述同法處理后檢測各組灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4.2 p－mTOR表達(dá)檢測 取第4代VSMCs以4×104種到50 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿貼壁24 h，饑餓24 h后更換10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基并加入AICAR其終濃度 0.5 mmol/L。分別在 30 min、1 h、2h、6 h、12 h抽提細(xì)胞總蛋白，取20 μg以4% ～12%的SDS－PAGE電泳，進(jìn)行分析并測灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次;另取第4代VSMCs以4×104接種到50 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿貼壁24 h，饑餓24 h后更換10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基并按不同組加入AICAR濃度0.5 mmol/L，PDGF －BB 濃度 10 μg/L，分為:A 組(AICAR)、P 組(PDGF)、A+P組(AICAR+PDGF)和對照組4個(gè)組，每組6個(gè)復(fù)孔，12 h采用凱基全蛋白提取試劑盒抽提細(xì)胞總蛋白，按上述同法處理后檢測各組灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 VSMCs的培養(yǎng)及鑒定

光鏡下可見，傳代培養(yǎng)的第4代細(xì)胞呈長梭形，及典型的“峰－谷”樣生長，經(jīng)免疫組化染色后，可見胞漿內(nèi)陽性著色的絲狀 α－actin分布，確認(rèn)為VSMCs，見圖 1、2。

Figure 1.The growth of VSMCs(×200)VSMCs at the 4th passage showed peak－valley－like growth.圖1 平滑肌細(xì)胞生長情況

Figure 2.Confirmation of VSMCs(×400).Positive－stained filamentous α － actin in the cytoplasm was obsered.圖2 平滑肌細(xì)胞染色確認(rèn)

2 PDGF及AICAR在不同時(shí)點(diǎn)對VSMCs增殖的影響

PDGF 干預(yù)24 h、48 h、72 h 后，明顯促進(jìn) VSMCs的MTT值升高(P＜0.05);AICAR在不同時(shí)點(diǎn)均可以使VSMCs的MTT值顯著下降(P＜0.05)，見表1。

表1 PDGF及AICAR作用不同時(shí)間對細(xì)胞MTT值的影響Table 1.Effects of PDGF and AICAR on MTT value at different time points(.n=5)

表1 PDGF及AICAR作用不同時(shí)間對細(xì)胞MTT值的影響Table 1.Effects of PDGF and AICAR on MTT value at different time points(.n=5)

*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs group P.P:PDGF;A:AICAR;A+P:AICAR+PDGF.

Group 24 h 48 h 72 h Control 0.136 ±0.012 0.188 ±0.016 0.261 ±0.0210.164 ±0.011* 0.253 ±0.011* 0.312 ±0.025*A 0.121 ±0.011* 0.149 ±0.011* 0.188 ±0.017*A+P 0.119 ±0.011*# 0.165 ±0.011*# 0.229 ±0.019*#P

3 AICAR對細(xì)胞AMPK的激活作用

AICAR干預(yù)細(xì)胞，分別在不同時(shí)點(diǎn)檢測到p－AMPK的表達(dá)，經(jīng)灰度分析顯示AMPK的激活隨藥物干預(yù)時(shí)間增加而逐漸增強(qiáng)，見圖3。

Figure 3.Expression of p－AMPK at different time points(Western blotting)..n=3.*P＜0.05 vs control.圖3 不同時(shí)點(diǎn)p－AMPK的表達(dá)

4 PDGF、AICAR及兩者聯(lián)合作用對細(xì)胞 p－AMPK的影響

各組干預(yù)細(xì)胞12 h后分別檢測p－AMPK的表達(dá)。與對照組比較，P組灰度值降低、A+P及A組均升高，A+P組高于P組，見圖4。

5 AICAR對磷酸化mTOR(p－mTOR)蛋白表達(dá)的影響

對照組細(xì)胞可見p－mTOR強(qiáng)表達(dá)，AICAR干預(yù)后p－mTOR表達(dá)活性減弱，隨著藥物干預(yù)時(shí)間延長，p－mTOR表達(dá)減弱更加明顯，見圖5。

Figure 4.Expression of p－AMPK at different groups(Western blotting)..n=3.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs group P.P:PDGF;A:AICAR;A+P:AICAR+PDGF.圖4 p－AMPK在不同干預(yù)組的表達(dá)

Figure 5.Expression of p－mTOR in different time points(Western blotting)..n=3.*P＜0.05 vs control.圖5 p－mTOR蛋白在不同時(shí)點(diǎn)的表達(dá)

6 PDGF、AICAR及兩者聯(lián)合作用對磷酸化mTOR的影響

各組干預(yù)細(xì)胞12 h后分別檢測p－mTOR的 表達(dá)。與對照組比較，P組灰度值增高、A+P及A組均降低，A+P組低于P組，見圖6。

Figure 6.Expression of p－mTOR in different groups(Western blotting)..n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs group P.P:PDGF;A:AICAR;A+P:AICAR+PDGF.圖6 p－mTOR蛋白在不同干預(yù)組的表達(dá)

討 論

在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中，以及冠狀動脈介入治療后都會出現(xiàn)血管增殖性改變，嚴(yán)重威脅著治療的進(jìn)展和疾病的預(yù)后，在這一環(huán)節(jié)中，血管中層平滑肌細(xì)胞是否進(jìn)入周期性的增殖狀態(tài)起著關(guān)鍵的作用。在正常血管壁完整的情況下，血管壁中層平滑肌細(xì)胞處于G0期的穩(wěn)定狀態(tài)，只有在一些刺激因素的作用下(如球囊損傷、PDGF的刺激)，才會觸發(fā)其增殖［5］。血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖成為冠心病急性事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，探討其增殖及抑制途徑對于防治急性冠脈事件的發(fā)生具有重要意義。

AMPK是一個(gè)蘇氨酸激酶，被認(rèn)為是所有真核細(xì)胞的能量感受器，激活的AMPK對腫瘤細(xì)胞的生長有強(qiáng)烈抑制作用，其效應(yīng)主要通過抑制細(xì)胞周期、胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成以及體內(nèi)脂肪酸和膽固醇的合成過程來實(shí)現(xiàn)。本研究顯示，AMPK的激活對血管平滑肌細(xì)胞的增殖亦起著顯著的抑制作用(P＜0.05)。

AICAR是被廣泛認(rèn)可的AMPK激活劑，可能是今后治療缺血性心臟病很有潛力的藥物［6］，AICAR通過腺苷載體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，在腺苷激酶的作用下被磷酸化形成5’－AMP類似物(zeatin riboside－5’－monophosphate，ZMP)，ZMP 具有 AMP 的類似結(jié)構(gòu)，它可以與γ亞基上的CBS序列結(jié)合，引起AMPK的構(gòu)象改變，同時(shí)保護(hù)抑制Thr172位點(diǎn)的去磷酸化，在磷酸化的作用下，使AMPK激活［7］。研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠股動脈的導(dǎo)絲損傷模型中，如果給予AICAR使AMPK能夠持續(xù)的激活，血管損傷處新內(nèi)膜的形成可受到明顯抑制，內(nèi)皮下平滑肌細(xì)胞的增殖也被明顯抑制［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在AICAR作用下p－AMPK的表達(dá)強(qiáng)度隨時(shí)間變化而逐漸增強(qiáng)，在12 h時(shí)達(dá)到最高值;PDGF干預(yù)后分別檢測p－AMPK，PDGF能抑制對照組AMPK的表達(dá)，但AICAR激活作用下PDGF抑制AMPK表達(dá)的效應(yīng)明顯減弱，同時(shí)，檢測 MTT值提示:AMPK的激活還可能抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMCs增殖效應(yīng)(P＜0.05)。其機(jī)制尚未明了，可能與促進(jìn)p53的表達(dá)上調(diào)和磷酸化，使血管平滑肌細(xì)胞增殖周期停滯在G1/S階段有關(guān)，其抑制增殖的效應(yīng)主要是通過抑制MAP激酶信號系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的［9］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AMPK激活后，p－mTOR的表達(dá)受到明顯抑制，在AMPK激活12 h后，其表達(dá)幾乎受到完全抑制，已知PDGF能誘導(dǎo)VSMCs增殖效應(yīng)，PDGF干預(yù)后檢測p－mTOR的 表達(dá)明顯增強(qiáng)，但AICAR加PDGF聯(lián)合干預(yù)后p－mTOR的 表達(dá)低于PDGF單獨(dú)誘導(dǎo)組，即PDGF對mTOR活性的上調(diào)效應(yīng)被AICAR抑制，進(jìn)一步提示AMPK激活后的抑制增殖效應(yīng)可能還與mTOR活性的下調(diào)有關(guān)，這中間可能同樣存在AMPK/mTOR信號途徑影響VSMCs的增殖。mTOR是細(xì)胞內(nèi)多種重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的樞紐，調(diào)控翻譯起始、轉(zhuǎn)錄、蛋白合成和降解功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存、增殖和凋亡等細(xì)胞重要生理功能，LKB1/AMPK/mTOR信號通路是其中較經(jīng)典的信號通路之一，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比值增高時(shí)，AMP與AMPK亞單位結(jié)合引起構(gòu)象的改變，然后LKB1與AMPK的α亞單位結(jié)合引起AMPK磷酸化而激活［10］，激活的AMPK通過使結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合體2(tuberous sclerosis complex 2，TSC2)磷酸化來阻斷mTOR的活化［11］。AMPK對 VSMCs的增殖抑制機(jī)制可能與mTOR下游的2個(gè)重要靶蛋白有關(guān)，即核糖體p70S6激酶(S6K1)和4E－BP1，兩者均參與蛋白翻譯的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［12］。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PDGF對VSMCs有促增殖效應(yīng)，AICAR干預(yù)后可激活A(yù)MPK，并顯著抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMCs增殖，細(xì)胞mTOR活性的下調(diào)可能參與了VSMCs的抑增殖效應(yīng)。

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