胡雅瓊 林渺滿 林 凡(福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 福州 350122)
胎牛血清對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1體外成血管實(shí)驗(yàn)影響的觀察△
胡雅瓊林渺滿林凡(福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院福州350122)
目的:觀察胎牛血清對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1體外成血管實(shí)驗(yàn)的影響。方法:人內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1采用相同的培養(yǎng)條件處理后,隨機(jī)分為無胎牛血清組和胎牛血清組,分別采用無胎牛血清培養(yǎng)基和含胎牛血清培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)接種于成血管基質(zhì)膠,培養(yǎng)6h后用倒置相差顯微鏡觀察不同處理組內(nèi)皮細(xì)胞血管管腔形成情況。結(jié)果:無胎牛血清組的血管管腔數(shù)明顯多于胎牛血清組(P<0.05)。結(jié)論:提示在體外成血管實(shí)驗(yàn)中無胎牛血清的條件有利于內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的形成。
HMEC-1細(xì)胞 胎牛血清 體外成血管
血管新生是機(jī)體從已有的毛細(xì)血管或毛細(xì)血管后靜脈發(fā)展形成新血管的過程,對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移,以及冠心病等缺血性疾病治療有著重要意義。隨著這些疾病日益危害人類的健康,血管新生研究領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注,有關(guān)血管新生的實(shí)驗(yàn)方法不斷發(fā)展。血管新生的過程涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、芽生、分裂和分支以及新的毛細(xì)血管網(wǎng)的形成。因此,毛細(xì)血管網(wǎng)的形成是內(nèi)皮細(xì)胞血管形成能力的最終體現(xiàn)。自從國(guó)外的研究者們發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下具有形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的能力,內(nèi)皮細(xì)胞體外成血管實(shí)驗(yàn)被廣泛應(yīng)用于血管新生研究[1~3]。但對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞體外成血管實(shí)驗(yàn)條件的研究還有一些盲點(diǎn)。胎牛血清是細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中的重要培養(yǎng)基添加劑,為細(xì)胞體外生長(zhǎng)提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和各種因子等。胎牛血清的添加是否影響內(nèi)皮細(xì)胞的體外成血管能力?我們針對(duì)上述問題進(jìn)行了研究,以期優(yōu)化內(nèi)皮細(xì)胞體外成血管實(shí)驗(yàn)方法,推動(dòng)研究的開展。
1.1主要材料與試劑:人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human microvascular endothelial cells,HMEC-1)由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)并保存,胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS,購(gòu)自美國(guó)Gibco公司),MCDB-131細(xì)胞培養(yǎng)基(由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)),表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Epidermal Growth Factor,EGF,購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司),氫化可的松(購(gòu)自BioBasic公司),碳酸氫鈉(購(gòu)自上海生工生物工程有限公司),0.25%胰蛋白酶(購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司),體外成血管試劑盒(In Vitro Angiogenesis Assay Kit,購(gòu)自美國(guó)Millipore公司)。
1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理
1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):HMEC-1細(xì)胞采用MCDB-131培養(yǎng)液(含10ng/ mL EGF、1μg/mL氫化可的松,10%FBS)于5%CO2,37℃常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化收集,制成單細(xì)胞懸浮液后,以20×104個(gè)/孔的密度接種于6孔板。細(xì)胞經(jīng)24h同步化后以含5%FBS MCDB-131培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。
1.2.2鋪設(shè)基質(zhì)膠:根據(jù)In Vitro Angiogenesis Assay Kit試劑盒說明書進(jìn)行操作,將基質(zhì)膠稀釋液與基質(zhì)膠按1∶9的比例混勻后,置于冰上按50μL/孔加入預(yù)冷的96孔板中,鋪平膠面后,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1h。
1.2.3細(xì)胞分組及體外成血管:將貼壁培養(yǎng)的HMEC-1細(xì)胞采用0.25%胰蛋白酶消化收集后,制成單細(xì)胞懸液,隨機(jī)分為胎牛血清組(5%FBS)和空白胎牛血清組(0%FBS)。然后將各組細(xì)胞懸液稀釋至16×104個(gè)/mL的密度,按毎孔150μL重新接種于鋪有成血管基質(zhì)膠的96孔板中,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后,觀察細(xì)胞出芽相互連接形成的管腔樣結(jié)構(gòu),在200倍相差倒置顯微鏡下取6個(gè)視野拍照(倒置熒光顯微鏡系統(tǒng),德國(guó)Leica公司),計(jì)數(shù)管腔形成數(shù)。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:本實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
在體外成血管實(shí)驗(yàn)中,內(nèi)皮細(xì)胞在基質(zhì)膠上生長(zhǎng)一段時(shí)間后出芽形成管腔。形成的管腔數(shù)可反映細(xì)胞的體外成血管能力。圖1顯示,空白胎牛血清組的血管管腔數(shù)明顯多于胎牛血清組(P<0.05),而且管腔更大,結(jié)構(gòu)更復(fù)雜,提示在體外成血管實(shí)驗(yàn)中無胎牛血清的條件有利于內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的形成。
內(nèi)皮細(xì)胞體外成血管實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛴行гu(píng)價(jià)某種特定因素對(duì)血管生成的影響,是體外血管新生研究的常用方法。一些實(shí)驗(yàn)研究表明,影響內(nèi)皮細(xì)胞體外成血管的因素眾多。本課題組的前期研究也發(fā)現(xiàn),不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)體外成血管有較大影響。胎牛血清含有細(xì)胞生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)成分和一些生長(zhǎng)因子,在細(xì)胞體外培養(yǎng)中起著至關(guān)重要的作用,亦可能是內(nèi)皮細(xì)胞體外成血管實(shí)驗(yàn)的重要影響因子。本研究通過觀察胎牛血清對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)體外成血管實(shí)驗(yàn)的影響,發(fā)現(xiàn)在胎牛血清存在或不存在的條件下,HMEC-1細(xì)胞均能在基質(zhì)膠上形成血管管腔樣結(jié)構(gòu)。但是相對(duì)于5%濃度的胎牛血清培養(yǎng)基,采用無胎牛血清的培養(yǎng)基接種細(xì)胞至基質(zhì)膠上形成的血管管腔數(shù)量更多,管腔更大,結(jié)構(gòu)更復(fù)雜,提示不含胎牛血清的培養(yǎng)基有利于HMEC-1細(xì)胞形成血管管腔結(jié)構(gòu),這與其他研究者結(jié)論類似[4~6]。胎牛血清含有的物質(zhì)大多來自母體,主要成分為多肽、蛋白質(zhì)和激素。其中一些物質(zhì)如促細(xì)胞增殖因子可促進(jìn)細(xì)胞增殖,胰島素有助于內(nèi)皮細(xì)胞分析,氫化可的松能促進(jìn)細(xì)胞增殖。因此,本研究的體外成血管過程中,胎牛血清的缺失可能抑制了人內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1的增殖,從而有利于誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分化和遷移,進(jìn)而更容易形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)[4]。這些結(jié)果為HMEC-1細(xì)胞體外成血管實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)化提供了有效依據(jù),有利于相關(guān)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。
[1]Folkman J and Haudenschild C.Angiogenesis in vitro[J]. Nature,1980,288:551-556.
[2]Maciag T,Kadish J,Wilkins L,et al.Organizational behavior of human umbilical vein endothelial cells[J].J.Cell.Biology,1982,94:511-520.
[3]Feder J,Marasa JC,and Olander JV.The formation of capillary-like tubes by calf aortic endothelial cells grown in vitro [J].J Cell Physiol,1983,116:1-6.
[4]Liu J,Wang XB,Park DS,et al.Caveolin-1 expression enhances endothelial capillary tubule formation[J].J Biol chem. 2002 Mar 22,277(12):10661-10668.
[5]Vailhe B,Lecomte M,Wiernsperger N,et al.The formation of tubular structures by endothelial cells is under the control of fibrinolysis and mechanical factors[J].Angiogenesis,1998,2(4):331-344.
[6]宋軼鵬,姜翠芳.ECV304細(xì)胞二維培養(yǎng)形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的觀察[J].首都醫(yī)藥,2006(10):35-36.
R329
B
1672-8351(2016)08-0111-02
國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81102844),福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2016J01389),福建中醫(yī)藥大學(xué)校管項(xiàng)目(X2013021),國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(201510393003)。