東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院 ■ 趙忠寶 徐鳳花 郭建全 李娜 黃剛

一 引言

目前國內(nèi)沼氣發(fā)酵以中、高溫為主，低溫研究尚處探索階段。有研究者認(rèn)為低于20℃沼氣發(fā)酵速度急劇下降。在我國北方由于低溫的限制，同樣數(shù)量的沼氣原料產(chǎn)氣量往往不及夏季的1/3，嚴(yán)重限制了沼氣在我國北方推廣。低溫季節(jié)進行沼氣發(fā)酵，如果人為加熱就會增加運行成本，因此，選育低溫高效的產(chǎn)甲烷復(fù)合菌系對低溫沼氣發(fā)酵具有重要的現(xiàn)實意義。

本試驗采用不同生境來源的樣品，利用溫度對微生物的選擇作用進行低溫馴化，以期選育出穩(wěn)定的低溫高效產(chǎn)甲烷復(fù)合菌系，為低溫沼氣發(fā)酵提供微生物資源及重要試驗參數(shù)。

二 材料與方法

1 材料

(1) 樣品來源

樣品取自稻田灌溉渠污泥D、沼氣發(fā)酵液Z、厭氧污泥Y、牛瘤胃液W等厭氧環(huán)境，用充滿氮氣的取樣瓶采集樣品1.5L，密封，盡量避免樣品與空氣接觸。

(2) 培養(yǎng)基(g/L)

K2HPO40.3，KH2PO40.3，(NH4)2SO40.3，NaCl 0.6，MgSO4·7H2O 0.13，CaCl2·2H2O 0.008，NaHCO35，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.002，Na2S·9H2O 0.5，L-半胱氨酸0.5，甲酸鈉2.5，乙酸鈉2.5，酵母膏2.0，胰蛋白胨2.0，0.1%刃天青2mL，青霉素(96萬單位/g)2.0，微量元素10.0mL，維生素溶液10.0mL。

微量元素液(g/L)：MgSO4·7H2O 3.0，CoCl20.1，MnSO4·2H2O 0.5，CaCl2·2H2O 0.1，NaCl 1.0，ZnSO4·7H2O 0.1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1，CuSO4·5H2O 0.01，AlK(SO4)20.01，H3BO30.01，NaMoO4·2H2O 0.01。

維生素溶液(mg/L)：硫胺素(維生素B1)5.0，泛酸鈣5.0，核黃素(維生素B2)5.0，鹽酸吡多醇10.0，生物素2.0，葉酸2.0，鈷胺素(維生素B12)0.1，煙酸(維生素B5)5.0，氨基苯甲酸5.0，硫辛酸5.0。

牛糞酸化液：取10kg牛糞與10L溫水混合均勻，自然酸化待pH值降至6時，用KHCO3溶液將其pH值調(diào)至7，用時將TS[1]調(diào)至8%。

2 方法

(1) 低溫產(chǎn)甲烷復(fù)合菌系的馴化

500mL葡萄糖瓶中裝300mL產(chǎn)甲烷菌富集培養(yǎng)液，然后驅(qū)氧、滅菌備用，再接入25%樣品，三次重復(fù)。密封后放入19±0.5℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)中，定期測定產(chǎn)氣量及CH4含量，將產(chǎn)氣量、CH4含量高的培養(yǎng)物繼代培養(yǎng)，直至獲得性能穩(wěn)定的復(fù)合菌系。

(2) 產(chǎn)氣量及氣體成分測定

以排水法測定產(chǎn)氣量，裝置如圖1。氣體成分分析采用氣相色譜GC-14C，TDX-01不銹鋼填充柱，80～100目，2m×3mm，TCD檢測器，載氣為氮氣(99.99%)，流速為35mL/min，進樣口溫度、柱溫、檢測器溫度分別為150、130、150℃，橋電流80mA。

以外標(biāo)法確定CH4含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，氣體檢測環(huán)境溫度為25℃。確定峰高與CH4含量的關(guān)系為y=0.002x?18.56，R2=0.998。

(3) 不同溫度對產(chǎn)甲烷活性影響研究

按照Hungate厭氧操作改良技術(shù)，取60mL富集培養(yǎng)物加入到240mL培養(yǎng)液中，在5、10、15、20、25、30、35℃不同溫度條件下進行培養(yǎng)，每個溫度處理設(shè)置3次重復(fù)，定期測定產(chǎn)氣量及甲烷含量。

(4) 碳源基質(zhì)研究

按照Hungate厭氧操作改良技術(shù)，取60mL富集培養(yǎng)物加入到240mL培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)液分別以甲醇、甲酸鈉、乙酸鈉為唯一碳源，設(shè)置3次重復(fù)，定期測定產(chǎn)氣量及甲烷含量。

(5) 統(tǒng)計分析方法

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS V17.0數(shù)據(jù)分析軟件進行統(tǒng)計分析，并用Tukey固定極差法進行多重比較差異顯著性。

(6) 形態(tài)觀察

Nikon YS100光學(xué)顯微鏡；熒光顯微鏡(DM4000B，德國Leica公司)；S-3400N掃描電子顯微鏡。

三 結(jié)果與分析

1 不同生境來源的復(fù)合菌系總產(chǎn)氣量變化動態(tài)

不同生境來源樣品在低溫馴化過程中隨著傳代次數(shù)的增加總產(chǎn)氣量也隨之增加，第6～8代總產(chǎn)氣量基本穩(wěn)定。不同復(fù)合菌系總產(chǎn)氣量變化動態(tài)如圖2所示。結(jié)合各代間總產(chǎn)氣量顯著性檢驗分析(表1)可知，復(fù)合菌系Y、D、Z總產(chǎn)氣量從第一代至穩(wěn)定代持續(xù)增加，并分別在第七、八、六代基本穩(wěn)定；復(fù)合菌系W總產(chǎn)氣量在第二代至第四代和第五代至第七代總產(chǎn)氣量增加幅度較大，第七代總產(chǎn)氣量開始穩(wěn)定；四個復(fù)合菌系穩(wěn)定時，總產(chǎn)氣量高低依次為D、Z、Y、W。

表1 不同復(fù)合菌系馴化過程總產(chǎn)氣量顯著性檢驗

四種低溫產(chǎn)甲烷復(fù)合菌系產(chǎn)氣量方差分析[2]：假設(shè)H0：μD=μZ=μY=μW，則HA：μD-μZ-μY-μW。根據(jù)F值表，當(dāng)df1=3，df2=3時，F(xiàn)0.05=9.28，F(xiàn)0.01=29.46，F(xiàn)=71＞F0.01=29.46＞F0.05=9.28，否認(rèn)H0推斷，四個低溫產(chǎn)甲烷復(fù)合菌系產(chǎn)氣量平均數(shù)差異顯著(表2)。

表2 不同低溫產(chǎn)甲烷復(fù)合菌系產(chǎn)氣量方差分析

Tukey固定極差法檢驗結(jié)果表明，不同環(huán)境來源的低溫產(chǎn)甲烷復(fù)合菌系產(chǎn)氣量差異達(dá)到極顯著(表3)?？梢姌悠穪碓床煌?，馴化穩(wěn)定后其產(chǎn)氣量差異顯著，因此產(chǎn)甲烷菌系馴化可有針對性地進行樣品采集。

表3 不同低溫產(chǎn)甲烷復(fù)合菌系產(chǎn)氣量平均數(shù)間差異Tukey固定極差法檢驗

2 不同低溫產(chǎn)甲烷復(fù)合菌系產(chǎn)氣動態(tài)

四種低溫產(chǎn)甲烷復(fù)合菌系產(chǎn)氣動態(tài)如圖3～圖6所示。接種培養(yǎng)一天后均有少量氣泡出現(xiàn)并緩慢向上涌動，復(fù)合菌系Y、W、D、Z分別在第3d、6d、6d、6d開始測定產(chǎn)氣。復(fù)合菌系Y從第6d至第26d出現(xiàn)多次產(chǎn)氣高峰而且產(chǎn)氣高峰較密集，產(chǎn)氣高峰僅間隔1～2d，高峰時日產(chǎn)氣量為115～150mL；第26d后產(chǎn)氣量基本穩(wěn)定，日產(chǎn)氣量在60～90mL持續(xù)10d；穩(wěn)定期后產(chǎn)氣量連續(xù)出現(xiàn)4次高峰，此階段產(chǎn)氣高峰間隔也在2d內(nèi)，而且最高日產(chǎn)氣量為190mL，較上一高峰期最高日產(chǎn)氣量提高27%；隨后產(chǎn)氣再次穩(wěn)定，最后產(chǎn)氣緩慢下降，64d產(chǎn)氣過程中CH4純度在50%以上達(dá)到57d。

復(fù)合菌系W產(chǎn)氣高峰期出現(xiàn)在第11d至第26d，此期間三次產(chǎn)氣高峰的高峰間隔均為4d，高峰時日產(chǎn)氣量為125～150mL；然后產(chǎn)氣基本穩(wěn)定，日產(chǎn)氣量在50～90mL持續(xù)32d；然后再次出現(xiàn)高峰，之后產(chǎn)氣下降，產(chǎn)氣67d中CH4純度在50%以上達(dá)到60d。

復(fù)合菌系D進入產(chǎn)氣高峰期后出現(xiàn)8次產(chǎn)氣高峰，并沒有明顯的產(chǎn)氣穩(wěn)定期，高峰時日產(chǎn)氣量在110～205mL持續(xù)39d，然后產(chǎn)氣緩慢下降，65d產(chǎn)氣過程中CH4純度在50%以上達(dá)到54d。

11～24d間復(fù)合菌系Z出現(xiàn)三次產(chǎn)氣高峰，兩次高峰間隔為6d和3d，高峰時日產(chǎn)氣量在150～180mL；第27d產(chǎn)氣量開始緩慢下降，日產(chǎn)氣量降到45mL時即第35d產(chǎn)氣又開始上升，當(dāng)升至80mL后趨于平穩(wěn)；第65d日產(chǎn)氣量再一次下降，第71d產(chǎn)氣結(jié)束，CH4純度在50%以上共有62d。

四種不同來源的樣品經(jīng)過19.5±0.5℃低溫馴化穩(wěn)定后，其總產(chǎn)氣量、甲烷含量及原料產(chǎn)氣率各不相同且差異較大，如表4所示。300mL體系料液濃度為8%時，復(fù)合菌系Y、W、D、Z的總產(chǎn)氣量分別達(dá)到5317.0mL、5046.0mL、5913.0mL、5645.0mL，甲烷含量依次為65.0%、61.0%、69.9%、67.5%，TS產(chǎn)氣率分別為222.00L/kg、214.00L/kg、246.00L/kg、235.00L/kg。目前研究相同物料濃度下的中溫發(fā)酵TS產(chǎn)氣率218～262L/kg[3,4]，可見復(fù)合菌系Y、W、D、Z均達(dá)到中溫產(chǎn)氣水平。

表4 產(chǎn)甲烷復(fù)合菌系的產(chǎn)氣特性

3 不同溫度對復(fù)合菌系D甲烷產(chǎn)量的影響

根據(jù)最適生長溫度(Topt)不同，研究者將產(chǎn)甲烷菌分為嗜冷(Topt低于25℃)、嗜溫(Topt約為35℃)、嗜熱(Topt約為55℃)和極端嗜熱(Topt高于80℃)4個類群[5]，其中嗜冷產(chǎn)甲烷菌又分為專性嗜冷產(chǎn)甲烷菌(Topt低于15℃)和兼性嗜冷產(chǎn)甲烷菌(Topt高于15℃)。由圖7可知，復(fù)合菌系D在5～20℃范圍內(nèi)，甲烷產(chǎn)量隨著溫度的升高逐漸提高；在20～35℃范圍內(nèi)隨溫度升高而下降；在20℃時，該復(fù)合菌系甲烷產(chǎn)量最高。為了驗證甲烷產(chǎn)量與溫度之間的關(guān)系，建立了二者之間的二次回歸方程見表5?；貧w方程驗證表明，復(fù)合菌系D在22.0℃培養(yǎng)條件下甲烷產(chǎn)量最高，因此22.0℃為其產(chǎn)甲烷最適宜溫度。在厭氧消化分類中小于25℃屬于嗜冷消化[6]，可見該復(fù)合菌系D能夠進行低溫厭氧發(fā)酵并且產(chǎn)氣指標(biāo)達(dá)到中溫產(chǎn)氣水平，進一步證明了嗜冷消化是可行的[7～9]。

表5 甲烷產(chǎn)量與溫度T的二次回歸方程(Y=aT2+bT+c)

4 不同碳源對復(fù)合菌系D甲烷產(chǎn)量的影響

產(chǎn)甲烷菌能夠利用甲醇、甲酸、乙酸等一碳或二碳化合物合成細(xì)胞物質(zhì)及甲烷，研究復(fù)合菌系中產(chǎn)甲烷菌營養(yǎng)類型可以為其提供最適碳源，提高甲烷產(chǎn)量。由表6可知，分別以甲醇和甲酸鈉為唯一碳源時，甲烷產(chǎn)量變化不明顯；乙酸鈉為唯一碳源時，甲烷產(chǎn)量低于甲醇和甲酸鈉。由此說明，該復(fù)合菌系中大部分產(chǎn)甲烷菌營養(yǎng)類型為甲基營養(yǎng)型，還有乙酸鹽營養(yǎng)型。Kleikemper2005年研究證明，甲烷八疊球菌科中的甲烷鬃毛菌屬只能利用乙酸鹽發(fā)酵產(chǎn)生能量，甲烷八疊球菌科中的絕大多數(shù)屬更易利用甲醇以及相關(guān)的甲基化合物產(chǎn)生甲烷。

表6 底物的利用

5 低溫復(fù)合菌系D的形態(tài)研究

產(chǎn)甲烷古菌細(xì)胞內(nèi)有兩種特有的F420和F342輔酶，能在一定波長范圍內(nèi)產(chǎn)生藍(lán)綠色熒光，因此熒光數(shù)量一定程度上可以反映產(chǎn)甲烷古菌的數(shù)量[10]。由圖8可以看出，復(fù)合菌系D經(jīng)過低溫馴化熒光數(shù)量有了大幅度的增加，亮度也強于馴化前，說明在低溫馴化過程中，產(chǎn)甲烷菌得到富集。

通過光學(xué)顯微照片和電鏡照片(圖9、圖10)可以看到，馴化后復(fù)合菌系D中桿菌數(shù)量減少，球菌數(shù)量增多，并以八疊球菌為主?，F(xiàn)報道的低溫產(chǎn)甲烷菌中八疊球菌有Methanosarcina、Methanococcoides、Methanolobus和Methanosaeta等甲烷八疊球菌目，樣品采集自南極[11]、高緯度湖水[12]、沼澤[13]、低溫厭氧反應(yīng)器等。復(fù)合菌系D樣品采集自稻田灌溉渠污泥，這與已報道的水稻土中占優(yōu)勢的產(chǎn)甲烷菌種群為甲酸甲烷桿菌(Methanbacterium formicicum)、馬氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina mazei)和巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina barkeri)[14]相一致。

四 結(jié)論

(1) 通過低溫馴化從不同生境樣品中選育出了復(fù)合菌系D、Z、Y、W，不同低溫產(chǎn)甲烷復(fù)合菌系間總產(chǎn)氣量差異達(dá)到極顯著水平，甲烷含量均達(dá)到60%以上，TS產(chǎn)氣率達(dá)到中溫產(chǎn)氣水平。

(2) 由溫度與甲烷產(chǎn)量間二次回歸方程驗證可知，復(fù)合菌系D在22℃培養(yǎng)條件下甲烷產(chǎn)量最高；碳源基質(zhì)研究表明菌系中大部分產(chǎn)甲烷菌營養(yǎng)類型為甲基營養(yǎng)型，還有乙酸鹽營養(yǎng)型；通過菌群形態(tài)研究，該復(fù)合菌系中以球菌為主，八疊球菌居多。

[1]鮑士旦,江榮風(fēng).土壤農(nóng)化分析(第三版)[M].北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社,2007:22－24.

[2]毛達(dá)如.植物營養(yǎng)研究方法[M].北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2002:192－201.

[3]王麗麗,楊廣林,李文哲,等.20～30℃牛糞厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣特性的試驗[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2006,37(6):791－795.

[4]張翠麗,李軼冰,卜東升,等.牲畜糞便與麥稈混合厭氧發(fā)酵的產(chǎn)氣量、發(fā)酵時間及最優(yōu)溫度[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報,2008,19(8):1817－1822.

[5]李美群,鄧潔紅,熊興耀,等.產(chǎn)甲烷菌的研究進展[J].釀酒科技,2009,179(5):90－93.

[6]Connaughton S,Collins G,O'Flaherty V.Psychrophilic and mesophilic anaerobic digestion of brewery effluent:A comparative study[J].Water Research,2006,40(13):2503－2510.

[7]Kettunen R H,Rintala J A.Performance of an on-site UASB reactor treating leachate at low temperature[J].Water Research,1998,32(3):537－546.

[8]Mahmouda N,Zeemana G,Gijzenb H,et al.Anaeobic sewage treatment in a one-stage UASB reactor and a combined UASBDigester sytem[J].Water Research,2004,38(9):2348－2358.

[9]Luostarinen S,Sanders W,Katarzyna K B.Effect of temperature on anaerobic treatment of black water in UASB-septictank systems[J].Bioresource Technology,2007,98(5):980－986.

[10]龐德公, 楊紅建.產(chǎn)甲烷菌的分離純化培養(yǎng)及其培養(yǎng)基對于菌株的選擇作用[J].中國畜牧獸醫(yī), 2010,37(6):32－35.

[11]丁維新,蔡祖聰.溫度對甲烷產(chǎn)生和氧化的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報,2003,14(4): 604－608.

[12]Earl J,Pickup R W,Ritchie D A,et al.Development of temporal temperature gradient electrophoresis for characterisingmethanogen diversity[J].Microbial Ecology,2005,50(3):327－336.

[13]Munson M A,Nedwell D B,Embley T M.Phylogenetic diversity of archaea in sediment samp les from a coastal saltmarsh[J].Applied and Environmental Microbiology,1997,63(12):4729－4733.

[14]陳美慈,閡航,錢澤澎.水稻田中產(chǎn)甲烷菌數(shù)量和優(yōu)勢種[J].土壤學(xué)報,1993,30(4): 432.