何希瑞，李茂星，尚小飛，賈正平，張汝學(xué)(.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050;2.蘭州大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

龍膽科龍膽屬植物全世界約有400余種，中國(guó)有247種，分布遍及全國(guó)［1］。龍膽屬植物作為中國(guó)的傳統(tǒng)藥用植物具有多種藥理活性。秦艽G.crassicaulis，具有祛風(fēng)除濕、活血舒筋、清熱利尿作用，治療風(fēng)濕、痹痛、筋骨拘攣［2］;龍膽G.scabra具有瀉肝膽實(shí)火、清下焦?jié)駸岬裙π?，用于治療肝?jīng)熱盛、驚厥狂躁、黃疸等疾病［2］。環(huán)烯醚萜苷及其衍生物是秦艽和龍膽植物的主要化學(xué)成分。龍膽苦苷作為重要的有活性的環(huán)烯醚萜苷成分，具有顯著地保肝、抗炎、抗菌等生物活性［3～5］。秦艽藥材富含油性并具有一定的芳香氣味，這一特性也常用于鑒定藥材的品質(zhì)。但對(duì)秦艽和龍膽的揮發(fā)油成分及其抗炎活性研究分至今未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用超臨界流體萃取法(SFE-CO2)提取了秦艽和龍膽的揮發(fā)油;用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)分析和鑒定了揮發(fā)油的化學(xué)成分;并采用體內(nèi)體外炎癥實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯績(jī)煞N揮發(fā)油的抗炎活性。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 粗莖秦艽G.crassicaulis于2008年8月份采自青藏草原;龍膽G.scabra藥材購(gòu)自甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，兩藥材均經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院馬志剛教授鑒定，符合中國(guó)藥典藥用標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞株與動(dòng)物 巨噬細(xì)胞RAW264.7由第二軍醫(yī)大學(xué)惠贈(zèng);清潔級(jí)昆明種小鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量22～24 g，蘭州生物制品研究所提供。

1.3 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基，Lipopolysac-charide(LPS)，四甲基偶氮唑藍(lán) (MTT)，Griess reagent和胰酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;小牛血清購(gòu)自杭州四季青公司;其它試劑均為分析純。

1.4 主要儀器 Speed SFE型超臨界萃取儀(美國(guó))，HP-GC-6890N-5973型GC-MS聯(lián)用儀(美國(guó))，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Forma Scientific公司)，OLMPUS IMT-2倒置顯微鏡(日本OLMPUS公司)，Multiskan MK3酶標(biāo)儀(美國(guó))，BP210S電子天平(賽多利斯有限公司)。

2 方法

2.1 揮發(fā)油提取 超臨界CO2萃取(SFE-CO2)法操作流程:CO2氣瓶→冷卻系統(tǒng)→高壓泵→萃取釜→分離釜→循環(huán)。將粉碎粒度為40目的秦艽、龍膽藥材投入0.5 L萃取釜中，萃取釜壓力20 Mpa，溫度45～50℃，萃取120 min后收集提取物。稱重后低溫保存，所得揮發(fā)油為淺黃色透明油狀物，具有芳香味。

2.2 氣相色譜-質(zhì)譜分析條件 色譜條件:Agilent DB-5MS(50 m ×0.25 mm ×0.25μm);色譜柱程序升溫條件:起始溫度40℃，以3℃/min的速率升溫至260℃并保溫10 min，載氣He。分流比10∶1，分流流量:9.9 ml/min，省氣流量:20.0 ml/min，進(jìn)樣量1.0 μl。質(zhì)譜條件:離子源電壓 70 eV，質(zhì)量分析器溫度150℃，離子源溫度230℃;離子掃描范圍為30～550 m/z。取SFE-CO2法得到的秦艽、龍膽揮發(fā)油(簡(jiǎn)寫(xiě) GCEO、GSEO)進(jìn)行 GC-MS檢測(cè)，解析質(zhì)譜，用面積歸一化法確定各成分的相對(duì)含量。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7加入含10%的胎牛血清(FBS)、100 U/ml青霉素、鏈霉素的無(wú)酚紅DMEM高糖培養(yǎng)基置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合后進(jìn)行傳代。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105cells/well，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μl。按實(shí)驗(yàn)要求將細(xì)胞分為正常對(duì)照組:常規(guī)DMEM培養(yǎng);LPS組:10 μg/ml LPS;GCEO+LPS組:GSEO+LPS組;鋪板24 h后棄掉培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液及藥物和LPS(10 μg/ml)。置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2.4 細(xì)胞活性的測(cè)定 調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×105cells/well，加入 96 孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔 200 μl，置37 ℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h 后，分別加入6、30 μg/ml的秦艽、龍膽揮發(fā)油 (對(duì)照組加正常培養(yǎng)液)，每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去上清液后，每孔加入180 μl新鮮 DMEM 培養(yǎng)液，再加入 20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入100 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解［6］，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處吸光值。

2.5 NO含量測(cè)定 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化后，調(diào)制成濃度為1×105cells/well的細(xì)胞液，每孔200 μl接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后加入秦艽、龍膽揮發(fā)油至終質(zhì)量濃度為 6、30 μg/ml，并加入50μl的10 μg/ml LPS;同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組和模型組，每組設(shè)6個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集各處理組培養(yǎng)細(xì)胞的上清液 100 μl，加入 100 μl Griess reagent試劑，室溫放置 10 min［7，8］。然后用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處各孔的吸光值。

2.6 二甲苯致耳腫脹試驗(yàn) 清潔級(jí)昆明種小鼠60只，雌雄各半。參照相關(guān)研究方法［9］，按體重隨機(jī)分為6組，秦艽、龍膽揮發(fā)油高劑量組120 mg/kg，低劑量組60 mg/kg，陽(yáng)性對(duì)照組(地塞米松10 mg/kg，DEX)及空白組(生理鹽水0.1 ml/g)。各組均腹腔注射給藥30 min后分別將30 μl二甲苯涂于小鼠右耳正反兩面，左耳不涂作為對(duì)照，1 h后處死小鼠。用直徑6 mm打孔器打下左右耳，稱重，左耳做對(duì)照，以左右耳片重量差作為腫脹度。計(jì)算腫脹抑制百分率。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行ANOVA方差分析，檢驗(yàn)分析不同組之間數(shù)據(jù)的差異顯著性。

3 結(jié)果

3.1 秦艽、龍膽揮發(fā)油化學(xué)成分的鑒定 按照上述實(shí)驗(yàn)條件，進(jìn)行GC-MS分析，得到秦艽、龍膽揮發(fā)油在Agilent DB-5MS柱上的總離子流程圖，圖1、圖2。

本實(shí)驗(yàn)采用計(jì)算機(jī)對(duì)各峰質(zhì)譜圖進(jìn)行NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索，根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行核對(duì)，并參考標(biāo)準(zhǔn)圖譜確定其化學(xué)成分，用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。本實(shí)驗(yàn)首次從秦艽和龍膽揮發(fā)性成分中鑒定出29個(gè)和40個(gè)化合物，定性結(jié)果和質(zhì)量分?jǐn)?shù)見(jiàn)表1、表2。

表1 秦艽揮發(fā)油的化學(xué)成分

3.2 秦艽、龍膽揮發(fā)油對(duì)RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 MTT比色法測(cè)定結(jié)果顯示6、30 μg/ml秦艽和龍膽揮發(fā)油均沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7的細(xì)胞毒性。證明在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的藥物劑量下，秦艽、龍膽揮發(fā)油并沒(méi)有細(xì)胞毒性，實(shí)驗(yàn)可行，結(jié)果如圖3所示。

表2 龍膽揮發(fā)油的化學(xué)成分

3.3 秦艽、龍膽揮發(fā)油對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO釋放的影響 試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，與空白對(duì)照組比較，模型組NO釋放量顯著增高，表示模型建立成功。與模型對(duì)照組相比較，6、30 μg/ml秦艽和龍膽揮發(fā)油均能明顯抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7的NO釋放量。其中，以30 μg/ml的秦艽、龍膽揮發(fā)油抑制作用最為顯著，抑制率分別達(dá)到56.3%、54.2%，提示秦艽、龍膽揮發(fā)油體外顯示了很好的抗炎活性。

3.4 秦艽、龍膽揮發(fā)油對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響 由表3可知，不同濃度的秦艽、龍膽揮發(fā)油高、低劑量組的耳重差與模型組比較，差異具有顯著地統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明秦艽、龍膽揮發(fā)油均能有效抑制由二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹，顯示了較強(qiáng)的抗炎活性。

表3 秦艽、龍膽揮發(fā)油對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響(n=10)

4 討論

4.2 由表1、2可知，從秦艽和龍膽揮發(fā)油中分別鑒定出29個(gè)和40個(gè)化學(xué)成分，但各自成分差異很大。粗莖秦艽富含(2e，4e)-2，4-decadienal(14.02%)，1-methyl-4-(1-methylethenyl)-benzene(12.69%)和 methyl-1，2-dihydro-2-oxo-quinoline-4-carboxylate(7.86%);而龍膽根中揮發(fā)油的主要成分是 n-hexadecanoic acid(16.50%)，hexanoic acid(9.11%)，diisobutyl phthalate(5.48%)，heneicosane(5.24%)和 octanoic acid(5.05%)。另外，從秦艽、龍膽揮發(fā)油中均鑒定出hexanal，1-octen-3-ol，heneicosane 和 1，7，7-trimethyl-(1R)-bicyclo［2.2.1］heptan-2-one等低極性成分。結(jié)合圖 1、圖2，秦艽所含揮發(fā)油成分富含醛、酚類成分，具有較短的保留時(shí)間和較小的分子量，而龍膽則富含脂肪酸類成分，保留時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，分子量較大。顯然，正是這種高含量的醛、酚類成分的存在而使得秦艽的根具有比龍膽更濃郁的香味。

4.2 NO被認(rèn)為是病理過(guò)程中的介質(zhì)和調(diào)節(jié)劑，特別是在急性炎癥應(yīng)答中，少量的NO對(duì)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)起著重要的調(diào)節(jié)作用，然而病理情況下誘導(dǎo)型NO合成酶合成大量的NO則有細(xì)胞毒作用，其可加重炎癥反應(yīng)并有致癌作用。因此，測(cè)定RAW264.7細(xì)胞釋放NO含量對(duì)評(píng)價(jià)秦艽、龍膽揮發(fā)油抗炎活性具有重要意義。如圖4所示，秦艽、龍膽揮發(fā)油均表現(xiàn)出對(duì)巨噬細(xì)胞NO生成的抑制作用，且抑制能力隨濃度增大而提高，顯示出一定的劑量依賴性。當(dāng)濃度為30 μg/ml時(shí)，秦艽、龍膽對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO生成的抑制率分別為56.3%、54.2%。其機(jī)制可能是通過(guò)抑制NO合成酶活性而發(fā)揮抗炎作用的。另外，作者考察了揮發(fā)油的體內(nèi)抗炎活性，實(shí)驗(yàn)以小鼠耳廓腫脹模型考察了秦艽、龍膽揮發(fā)油的體內(nèi)抗炎藥理學(xué)活性。結(jié)果表明，秦艽和龍膽揮發(fā)油均能夠明顯對(duì)抗由二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹，且呈現(xiàn)劑量依賴性。

4.3 本實(shí)驗(yàn)表明秦艽和龍膽的揮發(fā)油在體內(nèi)、體外均顯示了顯著的抗炎活性 2，4-decadienal，作為秦艽揮發(fā)油的主要成分，據(jù)報(bào)道能有效抑制TNF-α mRNA的基因表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用(5 μM，46%，P＜0.001)［10］;秦艽和龍膽揮發(fā)油中所含的另一個(gè)化合物hexanal，在200 μM 的劑量下同樣抑制 TNF-α mRNA 的基因表達(dá)(23%，P ＜ 0.001)［7］;n-hexadecanoic acid，作為龍膽揮發(fā)油的主要組成成分，據(jù)報(bào)道其具有免疫應(yīng)答作用，可以調(diào)節(jié)感染損傷后的炎癥。同時(shí)，據(jù)報(bào)道地龍揮發(fā)油的主要成分肉豆蔻酸(17.5%)和 n-hexadecanoic acid(16.9%)在二甲苯引起的小鼠耳腫脹模型中顯示出良好的抗炎活性，且其抗炎能力與脂肪酸類成分的含量高低密切相關(guān)［11］。因此，作者推斷秦艽、龍膽揮發(fā)油的抗炎作用歸因于此類醛和酸類成分的存在。另外，龍膽苦苷一直被認(rèn)為是秦艽、龍膽藥材的主要抗炎活性成分，據(jù)報(bào)道，300、150和50mg/kg龍膽苦苷皮下注射給藥可顯著抑制二甲苯引起的鼠耳腫脹，抑制率分別是56.3%，39.2% 和 14.5%［4］，而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) 120 mg/kg秦艽、龍膽揮發(fā)油在小鼠腫脹實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭型瑯颖憩F(xiàn)出顯著地抗炎活性，抑制率分別達(dá)到37.2% 和37.8%?？梢?jiàn)，龍膽苦苷和揮發(fā)油成分在秦艽、龍膽藥材的抗炎活性中均扮演著很重要的角色，因此揮發(fā)油也應(yīng)該得到重視以便更好的控制藥材質(zhì)量。

［1］中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志［M］.北京:科學(xué)出版社，1988:62.

［2］楊永昌.藏藥志［M］.西寧:青海人民出版社.1991:9.

［3］劉占文，陳長(zhǎng)勛，金若敏，等.龍膽苦苷的保肝作用研究［J］.中草藥，2002，33(1):47.

［4］陳長(zhǎng)勛，劉占文，孫崢嶸，等.龍膽苦苷抗炎藥理作用研究［J］.中草藥，2003，34(9):814.

［5］陳 雷，王海波，孫曉麗，等.龍膽苦苷鎮(zhèn)痛抗炎藥理作用研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2008，20:903.

［6］Tubaro A，F(xiàn)lorio C，Luxich E，et al.Suitability of the MTT-based cytotoxicity assay to detect okadaic acid contamination of mussels［J］.Toxicon，1996，34:965.

［7］Jeong GS，Lee DS，Kim YC.Cudratricusxanthone A from Cudrania tricuspidata suppresses pro-inflammatory mediators through expression of anti-inflammatory heme oxygenase-1 in RAW264.7 macrophages［J］.Int J Immunopharmacol，2009，9:241.

［8］Kim JB，Han AR，Park EY，et al.Inhibition of LPS-induced iNOS，COX-2 and cytokines expression by poncirin through the NF-κB inactivation in RAW 264.7 macrophage cells［J］.Biol Pharm Bull，2007，30:2345.

［9］Kou JP，Sun Y，Lin YY，et al.Anti-inflammatory activities of aqueous extract from Radix Ophiopogon japonicus and its two constituents［J］.Biol Pharm Bull，2005，28:1234.

［10］Girona J，Vallvé JC，Ribalta J，et al.2，4-Decadienal downregulates TNF-α gene expression in THP-1 human macrophages［J］.Atherosclerosis，2001，158:95.

［11］肖寄平，張煒煜.脂肪酸在地龍抗炎作用研究中的指示作用［J/OL］，長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，中醫(yī)中藥網(wǎng).