銅石龍子腸道細菌數(shù)量的變化與免疫機能的關系

朱雙杰，孟先科，張 瑩，陳 熙

（滁州學院化學與生命科學系，滁州 安徽 239000）

腸道是動物機體最大的儲菌庫[1]。正常情況下，腸道菌群對宿主的作用以及它們之間的相互作用有重要的生物學意義，在宿主生長、發(fā)育過程中，許多生理、免疫功能的完善，均有賴于腸道菌群的輔助，腸道菌群之間平衡是建立在相互拮抗、協(xié)同基礎上的[2]。一旦這種平衡遭到破壞，就造成微生態(tài)失調(diào)，將導致免疫力下降及各種疾病的發(fā)生[3－4]。微生態(tài)失調(diào)表現(xiàn)為細菌數(shù)量改變、菌群比例上的失調(diào)和細菌空間上的轉移[2]。有關菌群比例失調(diào)和細菌空間上的轉移對機體免疫力的影響有過報道[5]，而有關腸道細菌數(shù)量的變化對機體免疫力的影響未見報道。銅石龍子（Sphenomorphus indicus）捕食農(nóng)林害蟲，有益于農(nóng)林業(yè)，具有重要的生態(tài)價值；可入藥，破石林，止癢，利小便，又具有重要的經(jīng)濟價值。野外的銅石龍子由于環(huán)境的變化而瀕臨衰退，同時人工的養(yǎng)殖又存在困難，因此研究影響銅石龍子的免疫機能的因素有很重要的意義。本試驗以大黃、板藍根為手段改變銅石龍子腸道細菌的數(shù)量，以探討腸道細菌數(shù)量變化是否與銅石龍子免疫機能具有相關性，以期為蜥蜴類的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 采集與培養(yǎng)

銅石龍子采集與瑯琊山，先用面包蟲喂養(yǎng)7 d，再隨機分成3組，每組25只：A組于飲用水中添加2%大黃、B組于飲水中添加2%板藍根、C組飲水中不加中草藥作對照，均于上午9：00喂飲。試驗取樣于第1、2、4、7、14、21和28天進行。

1.2 培養(yǎng)基

淡水魚瓊脂培養(yǎng)基（FWA）[5]。

1.3 腸道菌群計數(shù)

1.3.1 菌液制備

取新鮮的糞便0.1 g，加水10 mL，勻漿，準確移取0.5 mL勻漿液，加4.5 mL無菌水，制成原液，10倍稀釋法，稀釋到107倍。

1.3.2 細菌的計數(shù)

平板菌落計數(shù)法。

1.4 血清溶菌酶活性的測定

1.4.1 采血樣制備血清

取樣分別在開始投藥餌前和投藥餌后第1、2、4、7、14、21和28天的上午9：00進行。各組蜥蜴斷頭法取血，將血直接放入滅菌的離心管中封口，置室溫下 l h，再以 2 000 r·min－1離心15 min，分離血清（用于溶菌酶活性的測定）。每次取樣3條，試驗重復3次。

1.4.2 溶菌酶活性的測定

酶活測定參照賈長虹[6]、李莉[5]的方法進行。

1.5 血液白細胞吞噬活性的測定

巨噬細胞活性的測定參照李莉[5]的方法進行。

2 結果與分析

2.1 飲食大黃和板藍根后銅石龍子腸道細菌數(shù)量的變化特征

結果見表1，銅石龍子腸道細菌數(shù)量在服用大黃、板藍根后均上升，第2天均高于對照組，大黃達（5.18±0.15）×107cfu·g－1，差異極顯著（P＜0.01），板藍根組達（4.59±0.32）×107cfu·g－1，達顯著水平（P＜0.05）。第4天達到最大值，大黃組達（7.99±0.20）×107cfu·g－1（P＜0.01），板藍根組達（6.14±0.31）×107cfu·g－1，相對于對照組，差異極顯著（P＜0.01）。而后腸道細菌數(shù)量開始下降，第7天及以后測得數(shù)據(jù)，大黃組和板藍根組與對照組無明顯差異。說明：喂飲大黃和板藍根后，銅石龍子腸道細菌數(shù)量有變化，其變化特征為：初期銅石龍子的腸道細菌的數(shù)量是增加的，但隨之腸道細菌數(shù)量很快下降至對照水平。

表1 喂飲大黃、板藍根后銅石龍子腸道細菌數(shù)量的變化Table 1 Change of number of bacteria in skink's alimental tract after drinking rhubarb and isatidis root(107cfu·g-1)

2.2 喂飲大黃和板藍根后銅石龍子蜥蜴血液中溶菌酶活性的變化

溶菌酶為正常機體免疫防御機制的組成部分，具有溶解病原細菌細胞壁的作用。結果見表2，銅石龍子在喂飲大黃和板藍根后，銅石龍子血液中溶菌酶活性呈上升趨勢。大黃組：第2天達84.72±0.35 μg·mL－1，方差分析，顯著高于對照組（P＜0.05），第7天及以后測得數(shù)據(jù)為113.04±0.31、116.52±0.29、98.37±0.43 和 102.33±0.31 μg·mL－1，均顯著高于對照組，差異極顯著（P＜0.01）。板藍根組：溶菌酶的活性從第2天達到104.31±0.27 μg·mL－1，顯著高于對照組，方差分析差異極顯著（P＜0.01），第4、7、14、21、28天此所測溶菌酶的活性均極顯著高于對照組（P＜0.01）。說明：喂飲大黃和板藍根后，銅石龍子血液溶菌酶的活性顯著增加。

表2 喂飲大黃和板藍根后銅石龍子血液溶菌酶活性的變化Table 2 Effect of rhubarb and isatidis root on activity of lysozyme of microphage in blood of skink（μg·mL-1）

2.3 喂飲大黃和板藍根后白條草蜥體液中抗體含量的變化

由表3可知，在喂飲大黃和板藍根，兩組后均表現(xiàn)出對抗原的免疫應答現(xiàn)象。兩試驗組在免疫后第4天兩試驗組的OD值分別為0.40、0.38，相比對照組的抗體效價OD值0.23差異顯著（P＜0.05），出現(xiàn)了免疫應答效應；并且，抗體效價繼續(xù)上升，兩試驗組在第7、14、21、28天大黃組的OD值分別為0.68、0.74、0.62、0.60，板藍根組的OD值分別為0.60、0.67、0.50、0.55，抗體效價的OD值均極顯著高于對照組的OD值（P＜0.01）。說明在喂飲大黃和板藍根后，白條草蜥血液抗體效價均顯著增加。

表3 大黃和板藍根對白條草蜥體液中抗體效價的影響（OD490nm）Table 3 Effect of rhubarb and isatidis root on antibody's valence in blood of takydromus wolteri

2.4 喂飲大黃和板藍根后銅石龍子血液中白細胞吞噬活性的變化

巨噬細胞來自血液中單核細胞，內(nèi)含溶酶體，具有粘附能力和強大的吞噬功能，在生物體內(nèi)是扮演清道夫角色，巨噬細胞的活性表現(xiàn)在兩個方面，一是全部巨噬細胞中參與吞噬的細胞數(shù)，另一個是每個巨噬細胞的吞噬能力。

由表4可知，大黃組，血液中的白細胞吞噬百分比在第7天為（70.69%±0.26%），顯著高于對照組（55.69%±0.38%）（P＜0.05），并隨著喂藥飼養(yǎng)天數(shù)的增加而上升，吞噬百分比在14 d達到（78.75±0.37），極顯著的高于對照組（57.32%±0.39%）（P＜0.01），吞噬百分比在21、28 d分別為（77.83%±0.36%）、（77.67%±0.28%），均極顯著高于對照組（P＜0.01）。板藍根組，第4天吞噬百分比為（64.19%±0.40%），顯著高于對照組（57.83%±0.32%）（P＜0.05），此后血細胞的吞噬百分比均顯著高于對照組，其中在第21、28天的吞噬百分比為（70.49%±0.32%）、（67.77%±0.30%），于對照組相比，差異極顯著（P＜0.01）。說明：銅石龍子在飲用大黃和板藍根后，巨噬細胞的活性先呈上升趨勢，很快高于對照組，并與對照組保持顯著差異。

在喂飲大黃和板藍根后，銅石龍子巨噬細胞的吞噬指數(shù)（PI）上升。大黃組，吞噬指數(shù)在第4天為（1.99%±0.05%），開始和對照組1.83±0.07顯出差異（P＜0.05），第 7天吞噬指數(shù)達（2.08%±0.05%），和對照組1.82表現(xiàn)出差異極顯著（P＜0.01），這種極顯著的差異保持到實驗結束。板藍根組，在喂飲大黃和板藍根后，吞噬指數(shù)迅速上升，第2天的吞噬指數(shù)為1.95。相比對照組（1.81%±0.06%），差異顯著（P＜0.05），第4天的吞噬指數(shù)為（2.04%±0.02%），顯著高于對照組（1.83%±0.07%），方差分析差異極顯著，此后的吞噬指數(shù)均極顯著的高于對照組（P＜0.01），（見表5）。說明銅石龍子在飲用大黃、板藍根后，每個巨噬細胞的吞噬指數(shù)明顯增加。

表4 喂食大黃、板藍根后銅石龍子血液巨噬細胞吞噬百分比的變化Table 4 Effect of rhubarb and isatidis root on phagocytic percentage of microphage in blood of skink(%)

表5 大黃和板藍根對銅石龍子噬細胞吞噬指數(shù)的影響Table 5 Effect of rhubarb and isatidis root on phagocytic indices of microphage in blood of skink

由以上兩個結果的分析可以看出，銅石龍子在飲用大黃和板藍根后，其血液里的巨噬細胞的吞噬活性迅速增加，并保持著和對照組的顯著差異。

3 討論

腸道細菌在腸道中起著生物屏障，有選擇性地抑制外源細菌的作用，使之不能定植[7]。消化道菌群除了直接抑制致病菌定植之外，還對動物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響[8]。動物體內(nèi)的正常菌群對于維護機體自身的免疫力有重要的作用，其免疫指標如巨噬細胞、免疫球蛋白、抗體等都與腸道細菌有著密切的相關性[9]。腸道細菌數(shù)量改變或種群比例上的失調(diào)或細菌空間上的轉移都可能是影響動物體的免疫力因素。在本試驗中，銅石龍子在飲用大黃和板藍根后，其消化道細菌數(shù)量變化特征是先增加，但很快就降至對照組水平，而與動物體免疫力相關的抗體效價、溶菌酶活性和巨噬細胞的吞噬能力是很快增加的，并且在增加后均保持著和對照組顯著的差異。腸道細菌變化的特征明顯和免疫力相關的抗體效價、溶菌酶的活性和巨嗜細胞的活性變化特征不同，沒有表現(xiàn)出相關性，說明腸道細菌數(shù)量的變化沒有對石龍子的免疫力產(chǎn)生影響。但本實驗中，銅石龍子的免疫力表現(xiàn)出了增強，這有可能是大黃和板藍根本身引起的，也可能是大黃和板藍根引起腸道菌群比例改變，益生菌在腸道內(nèi)比例增加，從而增強了銅石龍子的免疫機能，具體機制有待于進一步研究。

4 結論

a.大黃和板藍根對白條草蜥的免疫力具有促進作用，這種促進作用表現(xiàn)在大黃和板藍根提高了白條草蜥的抗體效價、溶菌酶活性以及巨噬細胞的吞噬活性。

b.大黃和板藍根對白條草蜥腸道細菌數(shù)量的改變有一定的作用，但這種作用與白條草蜥的免疫力無直接相關性。

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