張 映 劉富中 李香景 陳鈺輝 張振賢 方智遠(yuǎn) 連 勇

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京100081）

茄子（Solanum melongenaL.）是喜溫作物，在溫室反季節(jié)栽培及春季露地早熟栽培條件下，開(kāi)花期常由于低溫引起授粉受精不良，落花、落果，效益降低。茄子單性結(jié)實(shí)能克服低溫引起的落花落果障礙，坐果能力增強(qiáng)，產(chǎn)量顯著提高，同時(shí)還可改進(jìn)果實(shí)品質(zhì)，降低栽培成本（劉富中 等，2005；張映 等，2009）。因此，茄子單性結(jié)實(shí)特性的研究及單性結(jié)實(shí)基因的分離與克隆，對(duì)指導(dǎo)單性結(jié)實(shí)品種的育種工作，選育耐低溫、適宜保護(hù)地和露地早春栽培、優(yōu)質(zhì)無(wú)籽或少籽的茄子品種，具有重要的意義。目前，國(guó)內(nèi)外研究者先后對(duì)茄子單性結(jié)實(shí)的特性（田時(shí)炳 等，1999；劉富中 等，2005）、內(nèi)源激素的種類(lèi)和含量變化（武彥榮 等，2009；張偉春 等，2009）、胚胎及果實(shí)發(fā)育的解剖特點(diǎn)（張偉春 等，2008）、遺傳規(guī)律（田時(shí)炳 等，2003；劉富中 等，2008）、AFLP分子標(biāo)記（劉富中 等，2008；Shimomura et al.，2010）進(jìn)行了研究，并通過(guò)轉(zhuǎn)入外源嵌合基因DefH9-iaaM獲得轉(zhuǎn)基因單性結(jié)實(shí)茄子（Rotino et al.，1997），但有關(guān)茄子單性結(jié)實(shí)形成的分子機(jī)制和單性結(jié)實(shí)相關(guān)基因的分離克隆尚未見(jiàn)報(bào)道。

筆者利用SSH技術(shù)構(gòu)建了茄子單性結(jié)實(shí)果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的抑制差減cDNA文庫(kù)，含有2 347個(gè)陽(yáng)性克隆，測(cè)序、序列拼接后，共獲得1 248個(gè)高質(zhì)量的unigenes。本試驗(yàn)對(duì)獲得的差異表達(dá)unigenes在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析，并應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)，研究10個(gè)差異表達(dá)unigenes在不同結(jié)實(shí)性果實(shí)中的表達(dá)特性，以期獲得茄子單性結(jié)實(shí)相關(guān)基因，為進(jìn)一步克隆茄子單性結(jié)實(shí)基因，深入研究茄子單性結(jié)實(shí)基因的表達(dá)和調(diào)控機(jī)制及分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

茄子單性結(jié)實(shí)自交系D-10：在開(kāi)花結(jié)果期間日最低溫度在7～15 ℃之間時(shí)，表現(xiàn)單性結(jié)實(shí)，果實(shí)內(nèi)無(wú)種子，果實(shí)正常生長(zhǎng)發(fā)育；當(dāng)溫度適宜后，植株上部果實(shí)內(nèi)產(chǎn)生種子。非單性結(jié)實(shí)自交系03-2：在開(kāi)花結(jié)果期間日最低溫度在7～15 ℃之間時(shí)，果實(shí)不能正常膨大 （劉富中 等，2005）。試驗(yàn)材料于2009年春定植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所試驗(yàn)地內(nèi)。門(mén)茄開(kāi)花結(jié)果期間日最低溫度在9～15 ℃之間，單性結(jié)實(shí)特性完全表達(dá)，產(chǎn)生無(wú)籽果實(shí)，非單性結(jié)實(shí)品系果實(shí)不能正常膨大。四門(mén)斗開(kāi)花結(jié)果期間日最低溫度在 16～21 ℃之間，單性結(jié)實(shí)特性不表達(dá)，兩品系都產(chǎn)生正常有籽果實(shí)。分別取兩品系低溫時(shí)期（門(mén)茄）和適宜溫度時(shí)期（四門(mén)斗）開(kāi)花前7 d、開(kāi)花當(dāng)天、開(kāi)花后7 d和開(kāi)花后20 d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的子房或果實(shí)，迅速用液氮冷凍處理，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA的提取和cDNA的合成

單性結(jié)實(shí)品系和非單性結(jié)實(shí)品系的門(mén)茄和四門(mén)斗時(shí)期各取樣時(shí)間點(diǎn)均取 3個(gè)子房或果實(shí)作為一份材料，液氮研磨，用Omega的Plant RNA Kit提取總RNA。用1.0 %變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，利用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定其濃度和純度。將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)合格的RNA取5 μg，應(yīng)用SuperScriptTMⅢ反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen公司）合成cDNA第一鏈。

1.3 差減文庫(kù)序列分析

將測(cè)序結(jié)果去除載體和引物序列以后，使用Phrap軟件對(duì)Clean ESTs序列進(jìn)行組裝得到unigenes，將unigenes在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST序列比對(duì)分析，將比對(duì)結(jié)果E值低于1e-5的unigenes視為已知基因。

1.4 差異表達(dá)序列熒光定量PCR分析

以番茄ubiquitin為內(nèi)參基因（Cooper et al.，2004），選取 F1、Z351、Z358、Z569、Z599、Z603、Z613、Z622、Z626、Z707共10個(gè)差異表達(dá)unigenes，根據(jù)其核苷酸序列，應(yīng)用Primer Premier5.0軟件，設(shè)計(jì)退火溫度為57 ℃左右，引物無(wú)錯(cuò)配、二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)，產(chǎn)物為400 bp以下的基因特異引物，并將其在oligo 6里進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)引物的有效性和特異性。

反應(yīng)在LightCycler480熒光定量PCR儀（Roche）上進(jìn)行，所有PCR都設(shè)3次重復(fù)。反應(yīng)體系：總體積20 μL，模板8 μL，上下游引物各1 μL，SYBR Green Master Mix 10 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性 10 min，95 ℃ 10 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，45 個(gè)循環(huán)后作熔解曲線(xiàn)（95～65 ℃，0.1 ℃·s-1），實(shí)驗(yàn)所用的方法為雙標(biāo)法（唐永凱和賈永義，2008）。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作：將ss cDNA（單鏈cDNA）模板按5-1、5-2、5-3、5-4、5-5的梯度濃度稀釋?zhuān)謩e擴(kuò)增內(nèi)參基因和差異表達(dá)序列，根據(jù)其 CT值獲得內(nèi)參基因和差異表達(dá)序列的擴(kuò)增效率和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)D-10和03-2的門(mén)茄和四門(mén)斗時(shí)期各取樣時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)序列和內(nèi)參基因的 CT值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到不同結(jié)實(shí)性果實(shí)中不同時(shí)期的差異表達(dá)序列的相對(duì)表達(dá)量，使用Excel 2007軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達(dá)EST序列的比對(duì)分析

對(duì)所構(gòu)建的抑制差減cDNA文庫(kù)中的陽(yáng)性克隆，經(jīng)過(guò)測(cè)序拼接獲得1 248個(gè)unigenes，其中singletons 981個(gè)，contigs 267個(gè)。將1 248個(gè)unigenes在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行BLAST比對(duì)，比對(duì)結(jié)果中E值低于1e-5的有1 109個(gè)，占全部unigenes的88.86 %；與其他物種同源性低或者沒(méi)有可匹配的同源基因的unigenes所代表的可能是新基因，共139個(gè)，占11.14 %。筆者構(gòu)建的茄子單性結(jié)實(shí)SSH-cDNA文庫(kù)中部分unigenes的BLAST結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 SSH-cDNA文庫(kù)中的部分unigenes BLAST結(jié)果

2.2 熒光定量PCR基因特異引物設(shè)計(jì)

根據(jù)從構(gòu)建的抑制差減文庫(kù)中挑選出的10條差異表達(dá)的unigenes的核苷酸序列（表2），利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)退火溫度為57 ℃，產(chǎn)物小于400 bp的基因特異引物，以番茄ubiquitin為內(nèi)參基因（Cooper et al.，2004），經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確認(rèn)其能有效擴(kuò)增，且擴(kuò)增產(chǎn)物為單一條帶，表明設(shè)計(jì)的引物具有特異性（表2），可用于熒光定量PCR分析。

表2 熒光定量PCR所用的基因特異性引物

2.3 相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

10個(gè)unigenes均以u(píng)biquitin基因作為內(nèi)參基因，作相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以梯度稀釋的模板進(jìn)行PCR，構(gòu)建各差異表達(dá)unigene和內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并計(jì)算擴(kuò)增效率（表3）。各差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)都呈很好的線(xiàn)性關(guān)系，擴(kuò)增效率都大于0.9，適合進(jìn)行熒光定量比較。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，可以計(jì)算出要驗(yàn)證的10個(gè)unigenes的相對(duì)表達(dá)量。

2.4 差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

為了更準(zhǔn)確地鑒定SSH文庫(kù)中差異表達(dá)基因的可靠性，推測(cè)單性結(jié)實(shí)的形成機(jī)理，選取9個(gè)已知功能的 unigenes（F1、Z351、Z569、Z599、Z603、Z613、Z622、Z626、Z707）和 1個(gè)功能未知的unigene（Z358）（表1），采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析其在單性結(jié)實(shí)品系D-10和非單性結(jié)實(shí)品系03-2果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況（圖1）。由圖1可知，10個(gè)unigenes的表達(dá)情況大致可分為 3類(lèi)：在單性結(jié)實(shí)品系D-10中特異表達(dá)的 unigenes，包括 Z358、Z569、Z599、Z603、Z626和Z707；在非單性結(jié)實(shí)品系03-2適溫條件下特異表達(dá)的unigenes，包括F1和Z613；在單性結(jié)實(shí)和非單性結(jié)實(shí)品系中非特異性表達(dá)的unigenes，包括Z351和Z622。

Z569在單性結(jié)實(shí)品系低溫（門(mén)茄）和適溫（四門(mén)斗）時(shí)期果實(shí)的發(fā)育過(guò)程中具有相同的表達(dá)規(guī)律。在開(kāi)花前表達(dá)量逐漸升高，開(kāi)花當(dāng)天表達(dá)量最高，至開(kāi)花后7 d，表達(dá)量逐漸減少，開(kāi)花后7～20 d，表達(dá)量變化不大。Z569在單性結(jié)實(shí)品系低溫條件下的表達(dá)量高于在適溫條件下的表達(dá)量。Z569在單性結(jié)實(shí)品系低溫條件下（門(mén)茄）開(kāi)花當(dāng)天的表達(dá)量最高，約為適溫條件下單性結(jié)實(shí)品系和非單性結(jié)實(shí)品系果實(shí)中表達(dá)量的 2倍，為非單性結(jié)實(shí)品系低溫條件下表達(dá)量的3.08倍。因此，Z569可能在低溫下單性結(jié)實(shí)果實(shí)的發(fā)育過(guò)程中起重要的作用。

Z599在單性結(jié)實(shí)品系和非單性結(jié)實(shí)品系果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式不同。在單性結(jié)實(shí)品系中，開(kāi)花前的表達(dá)量高于開(kāi)花后的表達(dá)量，開(kāi)花當(dāng)天的表達(dá)量最高；而在非單性結(jié)實(shí)品系中，表達(dá)量隨子房和幼果的發(fā)育逐漸下降。Z707在單性結(jié)實(shí)品系低溫條件下開(kāi)花前的表達(dá)量逐漸下降，從開(kāi)花當(dāng)天起又逐漸升高，開(kāi)花后7 d表達(dá)量最高，之后又逐漸下降，而在非單性結(jié)實(shí)品系的果實(shí)和單性結(jié)實(shí)品系適溫下的有籽果實(shí)的開(kāi)花當(dāng)天表達(dá)量最高，表明 Z707在單性結(jié)實(shí)品系低溫條件下特異表達(dá)。

在低溫條件下，Z603在單性結(jié)實(shí)品系中的表達(dá)量低于在非單性結(jié)實(shí)品系的表達(dá)量；而Z626在單性結(jié)實(shí)品系中的表達(dá)量高于非單性結(jié)實(shí)品系。Z358在單性結(jié)實(shí)品系不同結(jié)實(shí)性果實(shí)發(fā)育中的表達(dá)模式是逐漸下降，在低溫條件下開(kāi)花前7 d的表達(dá)量變化不大；在非單性結(jié)實(shí)品系果實(shí)發(fā)育中的表達(dá)模式是在開(kāi)花前逐漸上升，開(kāi)花當(dāng)天的表達(dá)量最高，開(kāi)花后表達(dá)量逐漸下降。

F1在03-2四門(mén)斗有籽果實(shí)的開(kāi)花前7 d和開(kāi)花當(dāng)天的表達(dá)量高于其他3種果實(shí)，在開(kāi)花后7 d和20 d，4種不同結(jié)實(shí)性果實(shí)的表達(dá)量基本相同。Z613在03-2四門(mén)斗有籽果實(shí)中的表達(dá)模式是在開(kāi)花前7 d至開(kāi)花后7 d表達(dá)量逐漸減少，之后逐漸升高，在開(kāi)花后7 d表達(dá)量最低。而在其他3種果實(shí)中的表達(dá)模式則是完全相反，先上升后下降，在開(kāi)花后7 d表達(dá)量最高。

表3 差異表達(dá)基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及其擴(kuò)增效率

圖1 差異表達(dá)unigenes相對(duì)定量分析

Z351和Z622在單性結(jié)實(shí)和非單性結(jié)實(shí)品系不同果實(shí)的發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律基本相同，其表達(dá)模式是下降—升高—下降，Z351在開(kāi)花后7 d表達(dá)量最高（圖1）。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)對(duì)前期構(gòu)建的茄子單性結(jié)實(shí)抑制差減文庫(kù)中的一些重要的差異表達(dá) unigenes序列進(jìn)行分析，這些基因編碼的產(chǎn)物包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子MADS-box transcription factor和AP2/ERF transcription factor，果實(shí)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白 pistil extension-like protein、methionine fulfoxide reductase和3-ketoacyl-CoA synthase，細(xì)胞組分histone H3.2 precursor和ribosomal protein，以及與植物成花相關(guān)的光受體Cryptochrome和Prf interactor等，涉及到果實(shí)發(fā)育的多個(gè)方面。獲得部分與其他物種同源性低或沒(méi)有可匹配的同源基因的 ESTs，可能是新基因。這些基因的功能有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)得到的在單性結(jié)實(shí)子房和果實(shí)中上調(diào)表達(dá)的Z569，與控制番茄果實(shí)膨大的E4基因同源性高達(dá)89 %，其翻譯產(chǎn)物是甲硫氨酸亞砜還原酶（Cordes et al.，1989）。E4基因在膨大的果實(shí)中表達(dá)量高（即合成甲硫氨酸亞砜還原酶），在突變的番茄品種rin（果實(shí)膨大受阻型）中，E4基因的轉(zhuǎn)錄水平只有正常果實(shí)的1/10（DellaPenna et al.，1989）。這是因?yàn)樵谂虼蟮墓麑?shí)中代謝旺盛，產(chǎn)生大量的活性氧，活性氧會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的失衡和組織的損壞，由于甲硫氨酸亞砜還原酶的修復(fù)作用，保護(hù)了果實(shí)膨大過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白，使果實(shí)得以正常生長(zhǎng)和發(fā)育（Sadanandom et al.，2000）。熒光定量分析表明，在低溫條件下，單性結(jié)實(shí)品系D-10門(mén)茄開(kāi)花當(dāng)天子房中的Z569表達(dá)量最高，為非單性結(jié)實(shí)品系03-2門(mén)茄子房中表達(dá)量的3.08倍，約為單性結(jié)實(shí)品系和非單性結(jié)實(shí)品系適溫條件下四門(mén)斗有籽果實(shí)表達(dá)量的2倍。前期試驗(yàn)表明，單性結(jié)實(shí)品系D-10的單性結(jié)實(shí)性受低溫誘導(dǎo)表達(dá)（劉富中 等，2005），其單性結(jié)實(shí)果實(shí)的形成可能是Z569基因的大量表達(dá)，消除了低溫脅迫環(huán)境下（Berlett & Stadtman，1997）和果實(shí)膨大過(guò)程中（Dann & Pell，1989）產(chǎn)生的大量破壞性活性氧對(duì)一系列蛋白、脂肪和核酸的氧化作用，使子房正常發(fā)育成果實(shí)。因此推測(cè)Z569與單性結(jié)實(shí)相關(guān)。

Z707與乙烯合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑末端的乙烯響應(yīng)因子序列為同源序列，乙烯響應(yīng)因子作為表達(dá)調(diào)控因子，調(diào)控下游具有 GCC-box元件的基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)性狀的表達(dá)和脅迫的響應(yīng)（安豐英和郭衛(wèi)紅，2006）。近年來(lái)在擬南芥和番茄中的研究證明，乙烯可通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素的作用以及通過(guò)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用引起果實(shí)的自發(fā)膨大，形成單性結(jié)實(shí)（Vivian-Smith，2000；Linet al.，2008）。Z707在低溫條件下的單性結(jié)實(shí)品系中開(kāi)花前下調(diào)表達(dá)，開(kāi)花后上調(diào)表達(dá)，其可能通過(guò)調(diào)控乙烯的表達(dá)促進(jìn)果實(shí)的發(fā)育。

Z599與番茄中軟木脂和果皮表面的蠟粉合成有關(guān)的3 -酮脂酰輔酶A合成酶相似（Leide et al.，2007）；Z603與組蛋白H2A相似，H2A具有維持核小體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和染色質(zhì)凝聚的作用，還可作為調(diào)節(jié)因子綁定到特需的蛋白質(zhì)上，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)；Z626是一種光敏色素相互作用因子，通過(guò)光信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)環(huán)境條件的改變發(fā)生響應(yīng)（Jiaoet al.，2007）。熒光定量分析表明，Z599和 Z358在單性結(jié)實(shí)品系中特異表達(dá)，在低溫條件下，Z603在單性結(jié)實(shí)品系子房和果實(shí)的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中下調(diào)表達(dá)，Z626上調(diào)表達(dá)。這3個(gè)unigenes與功能未知的Z358在茄子果實(shí)中的具體功能、作用機(jī)制以及是否與單性結(jié)實(shí)相關(guān)還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

F1和Z613在03-2適溫條件下的四門(mén)斗果實(shí)中特異表達(dá)，可能與03-2四門(mén)斗果實(shí)中的種子數(shù)量最多有關(guān)。BLAST結(jié)果顯示F1與番茄中的單性結(jié)實(shí)相關(guān)基因Tm29相似性高達(dá)90 %，轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)和反義技術(shù)證明其可以引起單性結(jié)實(shí)（Ampomah-Dwamena et al.，2002）?；騎m29與擬南芥中的MADS-box基因家族中的SEPALLATA1、SEPALLATA2和SEPALLATA3基因具有相似性，已從擬南芥中分離出與胚珠發(fā)育密切的SEP基因（Favaroet al.，2003），研究發(fā)現(xiàn)若使SEP的活性減少，其正常的胚珠和種子的發(fā)育被打亂，一些胚珠變成葉狀或心皮狀的結(jié)構(gòu)，這些結(jié)果表明SEP基因?qū)τ谡５呐咧榘l(fā)育是必須的。因此，茄子單性結(jié)實(shí)果實(shí)中種子的缺失，可能是控制胚珠發(fā)育的SEP基因活性減小引起的。Z613與隱花色素同源，隱花色素在響應(yīng)外界環(huán)境、開(kāi)花調(diào)控和基因表達(dá)調(diào)節(jié)方面都具有重要作用（張小冰，2010），但其表達(dá)模式的改變是否調(diào)控果實(shí)的發(fā)育和種子的形成還需進(jìn)一步研究。

非特異性表達(dá)的ungenes Z351和Z622則可能與單性結(jié)實(shí)無(wú)關(guān)。

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