心律寧片劑中氧化苦參堿的萃取及其含量測(cè)定的研究

高洪燕 張 詠

黑龍江省醫(yī)院藥劑部，黑龍江哈爾濱 150036

苦參為豆科植物苦參的干燥的根，具有清熱燥濕、殺蟲止癢，利尿等功能。其有效成分生物堿含量較高，主要為：苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿等20余種。大多數(shù)單堿對(duì)多種類生物（如真菌、細(xì)菌、線蟲、昆蟲、哺乳動(dòng)物包括人類）有多方面的生物活性。尤其近年來發(fā)現(xiàn)的抗癌而又增強(qiáng)免疫力等獨(dú)特的藥理作用為醫(yī)藥界所矚目。

在超臨界CO2流體萃取（CO2-SFE）中，由于處于超臨界狀態(tài)下的CO2流體兼顧液體及氣體的傳質(zhì)特點(diǎn)，且超臨界CO2流體萃取的特性和極性還可以通過調(diào)節(jié)萃取壓力、溫度、加入不同品種的夾帶劑等因素方便的調(diào)節(jié)，從而使超臨界CO2流體萃取顯示了快速、提取效率高、選擇性好等特點(diǎn)[1]，中藥中的生物堿等極性偏大，加大壓力后，CO2流體的密度和解電常數(shù)增大，極性增強(qiáng)：加入夾帶劑也可有效地增大流體的溶解性能，促進(jìn)成分的溶出[2]。本實(shí)驗(yàn)用76%的乙醇作為夾帶劑對(duì)苦參中的氧化苦參堿進(jìn)行提取。并用高效液相色譜法，以YWG-NH2為固定相，乙腈-無水乙醇-磷酸水溶液為流動(dòng)相，測(cè)定氧化苦參堿的含量，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果介紹如下。

1 儀器和試劑

FY221-50-60型超臨界萃取裝置（哈爾濱市天宇科技開發(fā)有限公司）；美國WATERS高效液相色譜儀；600高壓雙泵；2996二極管陣列檢測(cè)器；7725i定量進(jìn)樣閥；Millenium 32系統(tǒng)軟件。

氧化苦參堿對(duì)照品由中國藥品生物制品檢定所提供；中藥材由黑龍江省綏化市藥品檢驗(yàn)所提供；檢定乙腈為HPLC級(jí)；水為純化水；二氧化碳（99.99%）由市化工廠提供；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：YWG-NH2，250 mm×4.6 mm，10μm，流動(dòng)相：乙腈∶無水乙醇∶水（80∶10∶10，磷酸調(diào)pH=2）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；用外標(biāo)法檢測(cè)。

2.2 超臨界CO2流體萃取的條件

2.2.1 堿化試劑的選擇 生物堿在植物中多數(shù)以鹽的形式存在，若直接用極性較弱的溶劑提取，往往提取不完全，所以在提取前需先堿化，使之全部轉(zhuǎn)化為游離堿，堿化劑可采用Ca（OH）2、三乙胺或氨水，由于Ca（OH）2不易溶于水，且易產(chǎn)生雜質(zhì)，而三乙胺對(duì)萃取槽的腐蝕性也較大，故本實(shí)驗(yàn)采用氨水作為堿化劑，以投料量的二倍量浸泡過夜。

2.2.2 萃取壓力的選擇[3]物質(zhì)處于其臨界溫度（Tc）、臨界壓力（Pc）以上時(shí)，成為單一相態(tài)，稱為超臨界流體。所以考察壓力對(duì)提取率的影響，必須選擇臨界壓力以上的壓力。在超臨界流體中，壓力越大，則流體的密度越大，萃取的能力越強(qiáng)，但對(duì)于雜質(zhì)的萃取量也隨之增加。CO2的臨界壓力為7.534 MPa。而在提取生物堿時(shí)，35 MPa和42 MPa樣品的提取率間有非常顯著的差異，但隨提取壓力的增加，雜質(zhì)的提取率也有增加，所以選擇42 MPa為本實(shí)驗(yàn)的萃取壓力。

2.3 氧化苦參堿的提取

苦參干粉末投料300 g，加0.1 mL/L氨水600 mL浸泡過夜，次日投入萃取釜中，于45℃、CO2流量0.70 nm3/h連續(xù)萃取。萃取過程中分3次加入夾帶劑約200 mL，1.5 h后第1次收集萃取液，以后每隔0.5 h收集一次，直到無萃取液產(chǎn)生。整個(gè)萃取過程約為2 h，收集萃取液約100 mL，其上層為淺黃至棕黃色透明液體，底部有少許棕黃色沉淀。

2.4 萃取液中苦參堿及氧化苦參堿的總含量測(cè)定

2.4.1 線性范圍 貯備液制備：精密稱取氧化苦參堿對(duì)照品2 mg，置25 mL量瓶中，用無水乙醇溶解，稀釋至刻度，搖勻備用。線性范圍：精密量取上述貯備液 0.25、0.50、1.50、2.50、3.50、4.50 mL置10 mL量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，按上述色譜條件進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，以對(duì)照液濃度（C）與其相應(yīng)峰面積（A）A=277762.0C-10870.0，r=0.9994，線性范圍為 0.4 ～ 0.5μg/mL。

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取線性方程中1、2、4號(hào)對(duì)照品，分別進(jìn)樣5μL，測(cè)定其峰面積，計(jì)算 RSD（n=5）分別為 0.9%、1.1%、1.7%。

2.4.3 加樣回收率 精密量取6份萃取液1 mL，分別加入儲(chǔ)備液0.5、1.0、1.5 mL置于10 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，以濾膜過濾，分別進(jìn)樣5μL，測(cè)量峰面積，計(jì)算加樣回收率平均為98.72%，RSD=3.2%（n=6）。

2.4.4 樣品測(cè)定 精密量取萃取液1 mL，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，以濾膜過濾，即得供試液，平行制樣5份。取上述溶液各5μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算氧化苦參堿含量。樣品色譜圖及對(duì)照品色譜圖，結(jié)果表明5份樣品的氧化苦參堿含量平均值為4.82%，RSD=2.13%。

2.4.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取線性方程中1、3、5號(hào)對(duì)照品，分別間隔1 h進(jìn)樣5μL，測(cè)定面積，計(jì)算變異系數(shù)RSD（n=5）為1.7%。隔日再取上述樣品進(jìn)樣，計(jì)算日間變異系數(shù)RSD（n=5）為1.2%。上述結(jié)果表明，氧化苦參堿其日內(nèi)日間均表現(xiàn)良好穩(wěn)定性。

3 討論

在夾帶劑的選擇中，常用的有乙醇、甲醇、苯等有機(jī)溶劑，考慮到生物堿易溶于有機(jī)溶劑，以及乙醇對(duì)儀器的腐蝕性最小，因此實(shí)驗(yàn)前擬定乙醇為夾帶劑。并根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]選取4種濃度的乙醇溶液（95%、80%、76%、70%）作為夾帶劑分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性驗(yàn)證，結(jié)果表明，以76%濃度的乙醇作為夾帶劑的提取率均高于其他3種濃度的乙醇作夾帶劑時(shí)的提取率，與文獻(xiàn)一致。

苦參中的生物堿主要有苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿等20余種[5]，其中苦參總堿占到全部生物堿的3%～5%。且在苦參的冷浸出液中，以氧化苦參堿為主，而加熱或煎煮可能使氧化型堿轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的非氧化型堿。由于在超臨界CO2流體萃取中，提取溫度不高，溫度變化范圍小，且提取條件穩(wěn)定，因此對(duì)于提取率標(biāo)識(shí)物的確定，選擇了氧化苦參堿。

在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于苦參中氧化苦參堿的提取時(shí)間為2 h，消耗有機(jī)溶劑為200 mL，氧化苦參堿提取率為4%～5%，其各項(xiàng)數(shù)值均優(yōu)于傳統(tǒng)的回流萃取法，充分顯示了超臨界CO2流體萃取的科學(xué)性。僅對(duì)超臨界CO2流體萃取的重要因素如夾帶劑、萃取溫度、萃取時(shí)間、萃取壓力進(jìn)行了考察。而影響超臨界CO2流體萃取的因素還有很多[6]，如分離壓力、CO2的流量及夾帶劑的流量等。且超臨界CO2流體萃取的條件決定了它特別適合于提取脂溶性成分，而利用超臨界CO2流體萃取生物堿的應(yīng)用并不廣泛，各種條件尚在探討之中，因此，利用超臨界CO2流體萃取法提取各種生物堿有待于更進(jìn)一步的研究。

[1] 龐樹和，田葳，潘淑明.HPLC法測(cè)定心律寧片（苦參總堿片）中苦參堿和氧化苦參堿的含量[J].中醫(yī)藥信息，2002，19（1）：15-17.

[2] 向柏，孫英華，張媛，等.RP-HPLC法測(cè)定苦參總堿中苦參堿、氧化槐果堿和氧化苦參堿 [J]. 中草藥，2005，36（12）：16-19.

[3] 艾雄，曾三平.高效液相色譜法測(cè)定當(dāng)歸苦參丸中苦參堿和氧化苦參堿[J].中南藥學(xué)，2007，5（2）：9-11.

[4] 章育中，張淑蓉，崔建芳，等.苦參及其制劑中生物堿的薄層分離和含量測(cè)定 [J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1981，10（4）：9-12.

[5] 張寶恒，申軍.抗心律失常中藥的研究進(jìn)展[J].中成藥，1981，9（5）：26-28.

[6] 龐樹和，田葳，潘淑明.HPLC法測(cè)定心律寧片（苦參總堿片）中苦參堿和氧化苦參堿的含量[J].中醫(yī)藥信息，2002，5（1）：52-53.