魯 哲,鄒振華,路 婧,王若仲

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物激素與生長發(fā)育湖南省重點實驗室,長沙 410128)

植物激素是植物體內(nèi)合成的對植物生長發(fā)育有顯著作用的微量物質(zhì)。目前,植物激素有六大類,即生長素類 (Auxins)、赤霉素類 (GAs)、細胞分裂素類(CTKs)、脫落酸 (abscisicacid,ABA)、乙烯 (ethyne,ET H)和油菜素甾醇(Brassinosteroids,BR)[1]。植物激素作為植物體內(nèi)的微量信號分子,調(diào)節(jié)植物幾乎所有的生長發(fā)育過程。長期以來,植物激素與植物生長調(diào)節(jié)劑一直是生物學(xué)和農(nóng)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點,其成果為農(nóng)業(yè)科技進步做出了巨大的貢獻。例如,各種植物生長調(diào)節(jié)劑的廣泛使用,已成為實現(xiàn)農(nóng)作物高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的重要措施之一,在推動“綠色革命”、大幅度提高作物產(chǎn)量和保證國家糧食安全方面發(fā)揮了不可替代的作用[2]。由于植物激素在植物體內(nèi)含量極低(一般每克植物組織鮮樣中的含量為 1～100 ng),易被光解、熱解和氧化,因此,如何對微量植物激素進行簡便、快速和準(zhǔn)確的定量分析,一直是植物激素研究領(lǐng)域的難題之一。近年來,隨著功能基因組學(xué)、代謝組學(xué)(metabolomics)等整體性“組學(xué)”方法的提出以及生物學(xué)研究對活細胞單分子行為測定的日益關(guān)注,對植物激素等重要代謝調(diào)節(jié)物的測定技術(shù)提出了更高的要求。同時植物激素的生理功能具有時空特異性,植物激素作用機理和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等前沿領(lǐng)域更是迫切需要對微量植物樣品的超微量植物激素進行高靈敏、原位、實時測定。研究植物激素在植物組織或細胞中的分布特點及消長規(guī)律,目前常采用化學(xué)手段對內(nèi)源激素水平進行檢測,但測定結(jié)果的準(zhǔn)確性較差[3],而且無法對激素進行定位研究,因為許多激素引起的很多生理反應(yīng)常發(fā)生在激素受體分布的細胞器內(nèi)[2],因此對植物激素的高靈敏、高通量、原位實時測定新技術(shù)提出了迫切要求。

傳統(tǒng)植物激素和植物生長調(diào)節(jié)劑測定方法主要有以早期簡單的小麥胚芽鞘切段伸長法為代表的生物測定法[4]、以氣相色譜法[5](Gas Chromatography,GC)和高效液相色譜法[6](High Performance Liquid Chromatography,HPLC)為代表的理化測定法,及以酶聯(lián)免疫吸附法[7](Enzyme Linked Immune sorbent Assays,ELISA)為代表的免疫測定法。傳統(tǒng)植物激素和植物生長調(diào)節(jié)劑測定方法各有優(yōu)缺點,下面分別進行評述。

1 生物鑒定法

生物鑒定法是最早使用的激素測定方法,它是利用激素作用于植株組織或器官后產(chǎn)生生理生化上的變化,通過該變化的大小推算植物激素含量的一種方法。1928年,荷蘭研究生 Fritz Went在研究燕麥胚芽鞘彎曲程度與瓊脂中生長素濃度的關(guān)系時,發(fā)現(xiàn)二者呈正相關(guān),這種測定法后來被稱為燕麥測試法[8]。生物鑒定法雖然簡單,對檢測儀器要求不高,但是對樣品純度要求高,專一性和重復(fù)性較差,近年來已很少使用。但對于從大量人工合成的化合物中篩選植物生長調(diào)節(jié)劑,生物鑒定法仍然是一種有效的植物激素定性分析方法[9]。

2 光譜及色譜檢測法

傳統(tǒng)光譜法如比色法測定植物激素,由于專一性差,已較少使用[10]。利用熒光技術(shù)與其它方法結(jié)合進行光譜測定的新方法成為光譜法檢測植物激素的主流方法。薛泉宏等[10]對以往的赤霉素?zé)晒鉁y定的方法進行了改進,該法適合于發(fā)酵液及固態(tài)產(chǎn)品中赤霉素的測定。光譜測定植物激素法近年鮮有報道。

色譜法是利用不同物質(zhì)在不同相態(tài)的選擇性分配,以流動相對固定相中的混合物進行洗脫,混合物中不同的物質(zhì)會以不同的速度沿固定相移動,最終達到分離的效果。早期采用的色譜測定方法主要是紙層析(Paper Chromatography,PPC)和薄層層析 (Thin Layer Chromatography,TLC),先將植物樣品通過層析進行分配再通過顯色等方法進行鑒定。這兩種方法操作簡便,所需設(shè)備簡單,但是分離效率和靈敏度有限,因而現(xiàn)在已很少單獨使用。將薄層層析與高效液相色譜(HPLC)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等檢測技術(shù)相結(jié)合可以有效地提高檢測的靈敏度。如李兆亮[11]等先用薄層層析純化樣品,然后利用 HPLC定量分析植物葉片中的水楊酸的含量,獲得了較理想的結(jié)果。

氣相色譜和高效液相色譜是 20世紀(jì) 60年代開始應(yīng)用于激素測定的技術(shù),現(xiàn)在已經(jīng)成為植物激素檢測的主要方法。氣相色譜法是指以氣體為流動相的色譜法。氣相色譜分析速度快,可用于分析測定所有的植物激素,但前提是待測激素必須形成易揮發(fā)的衍生物。大部分植物激素都含有極性基團,沸點較高,因此在進行GC分析前必須制備成為合適的揮發(fā)性衍生物[12]。已有一些衍生化方法被應(yīng)用于植物激素分析。如張有林等[13]用溴甲基五氟苯對 ABA和IAA進行衍生、酯化,在氣相色譜柱上分離效果良好,對電子檢測器反應(yīng)敏感,ABA和 IAA的最小檢測限各為 10-12g/mL和10-13g/mL。乙烯是以氣態(tài)存在的植物激素,因而可以不經(jīng)過衍生化直接用GC測定[14]。此外,杜黎明等建立了一種530μ m大口徑毛細管氣相色譜測定法,可以不經(jīng)衍生化處理,直接進樣[15]。 HPLC可用于除乙烯外的所有植物激素的分析檢測,其結(jié)果準(zhǔn)確性和靈敏度較高,且與 GC相比前處理簡單,對所測激素結(jié)構(gòu)無破壞,因此已經(jīng)成為植物激素測定的一種常用方法。HPLC可以選用不同的檢測器,如熒光檢測器[16]、紫外檢測器[17]等。其中紫外檢測器是一種較為常用的檢測方法。

由于 HPLC和 GC在測定過程中對保留時間的分辨有一定限制,若前處理過程達不到所需純度要求可能會出現(xiàn)幾種化合物的保留時間相同或接近而影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。將質(zhì)譜(Mass Spectrography,MS)技術(shù)與 HPLC或 GC聯(lián)合使用[18～21],可以有效地提高檢測的選擇性和靈敏度,因此儀器聯(lián)用是目前植物激素測定技術(shù)的發(fā)展趨勢。

3 傳統(tǒng)免疫檢測法

放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)是植物激素免疫測定傳統(tǒng)方法。放射免疫方法具有較高的靈敏度,但需要特殊的操作技術(shù)和實驗室設(shè)備,不適于作為常規(guī)檢測方法。相對而言,酶聯(lián)免疫吸附分析方法[22]應(yīng)用更為廣泛。但ELISA在靈敏度上還不能完全滿足實際樣品檢測的需要。因此開發(fā)間接的 ELISA法檢測 GA3,利用 GA3～ GA7免疫家兔得到的抗血清,建立了檢測結(jié)合態(tài) GA3的間接酶聯(lián)免疫吸附測定方法。免疫抗原與包被抗原用最常見的 DCC活化羧基與蛋白質(zhì)相聯(lián),檢測極限為 12.3 ng/m L,線性范圍 12.3～ 1 000 ng/mL?？寡迮c GA3的交叉反應(yīng)率為 2.3%,與 GA,IAA,ABA和 zR的交叉反應(yīng)率均很小[23]。隨著 ELISA技術(shù)的發(fā)展,利用該技術(shù)測定各類農(nóng)作物中植物激素在代謝中作用的實例日漸增多[24～27],并且獲得了穩(wěn)定的結(jié)果。近期,有報道運用免疫層析技術(shù)和液相電噴霧質(zhì)譜法結(jié)合的 ABA檢測方法,利用樣品在免疫層析凝膠的高專一性和靈敏度使其成為一種新型方便、高效和靈敏的分離純化方法[28]。

氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣-質(zhì)聯(lián)用 (GC/MS)或液-質(zhì)聯(lián)用(LC/MS)、酶聯(lián)免疫分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)等方法各有優(yōu)點,但都存在操作繁冗、靈敏度不佳、結(jié)果重復(fù)性差、儀器昂貴或者易出現(xiàn)假陽性結(jié)果等缺陷。因此,開發(fā)高靈敏、簡單、快速的用于植物激素檢測的方法非常緊迫。

4 生物傳感器檢測法

生物傳感器(biosensor)技術(shù)是將生物所具有的特性和電子裝置相結(jié)合的一種技術(shù),利用生物間特異的親和作用將信號轉(zhuǎn)換成能夠被識別的裝置。生物傳感器具有快速、實時、高度特異性和高靈敏度等優(yōu)點,能夠制備成用于快速現(xiàn)場檢測的裝置[29]。按分子識別元件將生物傳感器分為酶傳感器、免疫(抗原或抗體)傳感器、微生物傳感器、組織傳感器、細胞器傳感器、核酸傳感器、分子印跡傳感器等[30]。

生物傳感器還存在一定的局限性,如使用壽命、長期的穩(wěn)定性、批量生產(chǎn)工藝等都是生物傳感器研究、應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化亟待解決的。但是針對植物激素這樣一種極其不穩(wěn)定的物質(zhì),相比以往各種傳統(tǒng)方法,應(yīng)用生物傳感器測定植物激素含量,不但精確、高靈敏,而且具有操作簡單、快速、廉價、輕巧等優(yōu)點,因而是一種具有發(fā)展前景的植物激素測定方法。

近年來,利用生物傳感器技術(shù)針對植物激素的檢測有了很大進步。利用電化學(xué)生物傳感器方法檢測植物激素的方法逐年增多[31,32]。近年來,湖南省植物激素與生長發(fā)育重點實驗室,在壓電免疫傳感器、電化學(xué)傳感器及光學(xué)生物傳感器檢測植物激素方面有一定突破,是植物激素測定領(lǐng)域的又一拓展[33～36]。電化學(xué)傳感器和光學(xué)生物傳感器是微型化生物傳感器測定植物激素技術(shù)的必然發(fā)展趨勢。

5 非損傷微測定技術(shù)

非損傷微測技術(shù) (NoninvasiveMicrotest Technique,NMT)起源于美國 Marine Biology Laboratory(MBL)實驗室。 1990年 MBL的科學(xué)家Kǜ htreiber使用非損傷微電極測量了進出細胞的Ca2+流速和運動方向,開創(chuàng)了生物活體靜態(tài)測量到動態(tài)測量轉(zhuǎn)變的先河[37]。 1995年 MBL的科學(xué)家在《Nature》發(fā)表文章闡明了非損傷微測技術(shù)的數(shù)學(xué)、物理學(xué)基礎(chǔ)以及應(yīng)用方式,進一步完善了非損傷微測技術(shù),從此非損傷微測技術(shù)進入各研究領(lǐng)域并發(fā)揮著越來越重要的作用[38]。 2010年8月,普渡大學(xué)的科學(xué)家發(fā)展了一種用碳納米管技術(shù)研制的生長素(IAA)微電極,結(jié)合非損傷微測技術(shù)測定了玉米株系 B73和突變體 Br2中IAA的分布和運輸[39]。研究表明,非損傷微測技術(shù)與信號解耦聯(lián)、整合流速相結(jié)合,利用菲克第一定律,可測定玉米根中內(nèi)源性IAA的流速。該研究使用非損傷微測技術(shù)實時地測定了根表面的 IAA流速,可為研究生長素的極性運輸,感受重力,研究活體植物根的發(fā)育和幼苗的調(diào)控機制提供重要幫助。

6 展 望

植物激素對植物生長發(fā)育及代謝有重要作用,對其進行準(zhǔn)確、快速、高靈敏、高通量、原位實時定量測定成為一項必然的工作。傳統(tǒng)植物激素和植物生長調(diào)節(jié)劑測定方法各有優(yōu)缺點,以高效液相色譜法為代表的理化檢測法依然是現(xiàn)今植物激素檢測的主流,但是多與儀器聯(lián)用進行檢測,檢測成本較高。隨著生物傳感器法對植物激素測定的日益完善,可以達到實時快速測定、檢測成本不高,進一步解決原位檢測的困難,其將有很大的發(fā)展空間。非損傷微測技術(shù)在生物微傳感器方面的應(yīng)用,值得密切關(guān)注。非損傷微測技術(shù),其優(yōu)勢在于對植物無損傷,原位實時進行植物激素的檢測,有較為廣闊的應(yīng)用前景,但目前因為技術(shù)原因,對測定痕量植物激素方法有待進一步提高。將非損傷微測技術(shù)與生物傳感器聯(lián)合應(yīng)用于對植物激素檢測將是未來植物激素檢測的必然趨勢。

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