王慧玲 張曉霞 韓美艷 李婷婷 劉 偉

(1.鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450052;

2.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450000)

桔梗(Platycodon grandiflorum A.DC)為桔?？贫嗄晟荼局参?，藥用其根，春、秋二季采挖，洗凈，除去須根，趁鮮剝?nèi)ネ馄せ虿蝗ネ馄?，干燥。我?guó)最早的一部藥書《神農(nóng)本草經(jīng)》已有記載，系常用中藥。桔梗性味苦、辛、平，歸肺經(jīng)，具有宣肺，利咽，祛痰，排膿之功效。用于咳嗽痰多、胸悶不暢、咽痛、音啞、肺癰吐膿、瘡瘍膿成不潰等癥［1］。桔梗根中含有大量由果糖組成的桔梗聚糖，此外，桔梗中還含有大量的菊糖［2］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)桔梗多糖具有很好的抗腫瘤和增強(qiáng)機(jī)體免疫活性的作用［3－4］，而多糖的含量直接影響其藥效的發(fā)揮，但是目前國(guó)內(nèi)外對(duì)多糖含量的研究基本上測(cè)定的都只是總糖的含量而非總多糖的含量［5－6］。因此本文擬通過(guò)以桔梗為模型，研究簡(jiǎn)單且準(zhǔn)確的多糖含量測(cè)定的方法，為以后桔梗多糖的進(jìn)一步研究與應(yīng)用提供參考和依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

桔梗:產(chǎn)地是安徽亳州，經(jīng)鄭州大學(xué)生藥系潘成學(xué)老師鑒定為Platycodon grandiflorum A.DC。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

3，5－二硝基水楊酸(化學(xué)純)，G －25(臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE－52AA(上海亞榮生化儀器廠)，臺(tái)式高速離心機(jī)TDL－5－A(上海安亭科學(xué)儀器廠)，分析天平AR1140(梅特勒－托利多儀器上海有限公司)，SHZ－D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 桔梗多糖的提取

桔梗粉末→石油醚脫脂(60～90℃)→80%乙醇回流提取→熱水浸提→趁熱過(guò)濾→殘?jiān)貜?fù)提取三次→合并提取液→減壓濃縮→Sevag法除蛋白(多糖濃縮液:氯仿:正丁醇=25:5:1)→無(wú)水乙醇沉淀(含醇量達(dá)80%)→靜置過(guò)夜→抽濾→無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌沉淀→桔梗多糖。

2.2 多糖換算因子的測(cè)定

精確稱取干燥至恒重的桔梗精制多糖20mg，置于100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得桔梗多糖貯備液。吸取0.4ml貯備液置25ml具塞試管中，按總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法中“加蒸餾水至2ml”起操作。測(cè)定其吸光度，由回歸方程求出此精制桔梗多糖貯備液中葡萄糖質(zhì)量濃度，平行測(cè)定6次。按下式計(jì)算換算因子f:

f=W/(C×D)

式中:W為稱取多糖的質(zhì)量(mg)，C為精制桔梗多糖貯備液中葡萄糖質(zhì)量濃度(mg/ml)，D為多糖的稀釋倍數(shù)。測(cè)得f=1.3127。

2.3 桔梗多糖含量測(cè)定

2.3.1 總糖的含量測(cè)定

2.3.1.1 蒽酮試劑的配制

稱取0.1g蒽酮，加入50ml濃硫酸攪拌溶解，放置暗處，此試劑需臨用新配。

2.3.1.2 蒽酮硫酸法測(cè)總糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖10mg，于100ml容量瓶中溶解并定容至刻度，即得到濃度為0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。

精密吸取0.1mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml分別置于干燥具塞試管中，分別加入蒸餾水至2ml，搖勻，于冰浴中小心自管壁加入蒽酮試劑5ml，加塞，混勻，保持混合物冷卻，沸水浴中加熱10min，取出冷卻，以蒸餾水作空白(即0號(hào)管)，于620nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為A=0.0126C+0.0064(R2=0.9994)。

2.3.1.3 桔?？偺呛繙y(cè)定

稱取干燥粗多糖10mg，加水溶解后轉(zhuǎn)至100ml容量瓶中稀釋至刻度。吸取0.8ml，置干燥具塞試管中，按照“2.3.1.2”中標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法操作，平行測(cè)定3次，并按下式計(jì)算總糖含量(以葡萄糖計(jì)):總糖含量(%)=CD/W×100%。式中:C為樣品溶液的葡萄糖的濃度(μg/ml)，D為樣品溶液的稀釋因子，W為稱取的干燥粗多糖的重量(μg)，測(cè)得總糖含量為76.56%。

2.3.2 桔梗多糖中還原糖的含量測(cè)定

2.3.2.1 3，5 二硝基水楊酸法(DNS 法)

2.3.2.1.1 DNS 試劑的配制

將6.3g的3，5－二硝基水楊酸和262ml 2mol/L NaOH溶液加到500ml含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g的苯酚和5g亞硫酸鈉攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1000ml，貯于棕色瓶中備用。

2.3.2.1.2 DNS 法測(cè)還原糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖 100mg，于100ml容量瓶中溶解并定容至刻度，即得到濃度為1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。

精密吸取 1mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml分別置于 25ml具塞試管中，加蒸餾水使成2ml，搖勻，各加DNS試劑1.5ml搖勻，置沸水浴中加熱5min，取出冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25ml，加塞后搖勻，以蒸餾水作空白(即0號(hào)管)，于540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以濃度(mg/ml)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程 A=0.988C －0.0191(R2=0.9998)。

2.3.2.1.3 DNS 法測(cè)樣品還原糖含量

取干燥樣品1g，加水溶解后轉(zhuǎn)至100ml容量瓶中稀釋至刻度。按“2.3.2.1.2”標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法操作，平行測(cè)定3次。還原糖含量計(jì)算公式同“2.3.1.3”中總糖含量計(jì)算公式，測(cè)得還原糖含量為5.75%(以葡萄糖計(jì))。

2.3.2.2 間接碘量法

2.3.2.2.1 碘量法測(cè)還原糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取105℃下干燥至恒重的葡萄糖1g，溶解于水，在100ml容量瓶中稀釋至刻度，得到10mg/ml的葡萄糖溶液。

分別精密量取0.5，1.0，2.0，3.0，4.0ml的上述葡萄糖溶液至250ml碘量瓶中，補(bǔ)加水至50ml，各加入5ml I2溶液，15ml 0.1mol/L的NaOH溶液，搖勻，放置暗處15min，取出，加入4ml 0.5mol/L HCL搖勻。用0.1mol/L的Na2S2O3滴定至淺黃色，加入0.5%的淀粉指示劑，續(xù)滴至黃色消失。記錄消耗的Na2S2O3體積。以空白與樣品所耗硫代硫酸鈉溶液毫升數(shù)之差為縱坐標(biāo)，葡萄糖毫克數(shù)為橫坐標(biāo)作線性回歸。得到回歸方程為 y=0.1102x －0.2361(R2=1)。

2.3.2.2.2 碘量法測(cè)樣品還原糖含量

取干燥樣品2.5g，加水溶解后轉(zhuǎn)至250ml容量瓶中稀釋至刻度。取50ml樣品液置250ml碘量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法，自“各加入5ml I2溶液”起，依法測(cè)定，平行測(cè)定3次。以空白與樣品液所耗的硫代硫酸鈉溶液毫升數(shù)之差，帶入葡萄糖回歸方程中，計(jì)算相應(yīng)的葡萄糖毫克數(shù)。測(cè)得還原糖含量為2.65%(以葡萄糖計(jì))。

2.3.3 多糖的含量測(cè)定結(jié)果

2.3.3.1 DNS 法

多糖含量=(總糖含量－還原糖含量)×f×100%=70.81%

2.3.3.2 間接碘量法

多糖含量=(總糖含量－還原糖含量)×f×100%=73.91%2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

凝膠層析是一類利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠的層析技術(shù)，根據(jù)小分子物質(zhì)可以進(jìn)入凝膠篩孔中，而大分子物質(zhì)被排阻在其外的原理［5］，使不同分子量的物質(zhì)可以分開(kāi)。因此可應(yīng)用凝膠層析法脫去粗多糖中的小分子糖類，從而使大分子多糖能與小分子糖分開(kāi)。

2.4.1 上樣與洗脫

取藍(lán)色葡聚糖2000和β－環(huán)糊精各2mg上樣。以蒸餾水洗脫，流速0.5ml/min，每10min收集一管，用蒽酮－硫酸法跟蹤檢測(cè)，以測(cè)出該凝膠柱的外水體積和小分子的洗脫體積。然后將多糖溶液上樣，以蒸餾水洗脫，流速0.5ml/min。

2.4.2 含量測(cè)定

2.4.2.1 還原糖含量測(cè)定

合并小分子糖的洗脫液(以β－環(huán)糊精開(kāi)始流出時(shí)收集)，精密吸取洗脫液2ml，按照DNS法測(cè)還原糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法操作，平行測(cè)定3次，測(cè)得還原糖的含量為2.72%(以葡萄糖計(jì))。

2.4.2.2 總糖的含量測(cè)定

合并全部的洗脫液，精密吸取洗脫液1ml于10ml容量瓶中定容，然后吸取 0.6ml，按照“2.3.1.2”中標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法操作，平行測(cè)定3次，測(cè)得總糖含量為73.82%(以葡萄糖計(jì))。

2.4.2.3 多糖含量測(cè)定結(jié)果

多糖含量=(總糖含量－單糖含量)×f×100%=71.10%

通過(guò)葡聚糖凝膠層析法測(cè)得多糖的含量與前面三種方法測(cè)得的多糖含量基本一致。

3 討論

苯酚－硫酸法和蒽酮－硫酸法測(cè)定的是樣品中總糖的含量，不能排除還原性雜質(zhì)(包括還原糖性的單糖)的干擾，因此本文用之于總糖的測(cè)定。苯酚－硫酸法中苯酚極易被空氣氧化，這給重蒸餾帶來(lái)困難，而且苯酚本身有毒，操作不便。蒽酮－硫酸法存在顯色劑極易氧化而影響比色的問(wèn)題，可通過(guò)現(xiàn)用現(xiàn)配的方法來(lái)解決。相比苯酚－硫酸法，蒽酮－硫酸法適用于少量樣品測(cè)定，操作方便，本文選用后者。

間接碘量法在滴定的過(guò)程中，剩余碘會(huì)不可避免地?fù)]發(fā)，導(dǎo)致滴定誤差。同時(shí)，滴定要求在短時(shí)間內(nèi)完成，加大了操作難度以及終點(diǎn)的判斷延后。試劑昂貴也是此法的一個(gè)缺點(diǎn)。

DNS法試劑穩(wěn)定性高，可在相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)使用，操作方便。

綜合實(shí)驗(yàn)成本、設(shè)備、操作及影響測(cè)定因素等方面考慮，選用蒽酮－硫酸法與DNS法相結(jié)合測(cè)定桔梗多糖的含量。該法重復(fù)性好，靈敏度高，而且該法省去了過(guò)柱子的繁瑣，節(jié)約了時(shí)間。

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