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      種子染菌成因探析及防治

      2011-08-15 00:48:10何鑒清
      關(guān)鍵詞:滅菌器雜菌冷凝水

      何鑒清

      (江蘇江山制藥有限公司,江蘇靖江 214500)

      種子染菌成因探析及防治

      何鑒清

      (江蘇江山制藥有限公司,江蘇靖江 214500)

      種子染菌嚴重影響發(fā)酵生產(chǎn),會增加生產(chǎn)成本。文章分別從物品滅菌、種子制備環(huán)境、無菌操作和設(shè)備等幾個方面來闡述維生素C菌種在制備過程中的種子帶菌原因,操作人員在工作中的注意事項,以及誤判為種子帶菌等情況,并用實例加以分析說明,提出防治措施,在菌種生產(chǎn)中對避免和防止雜菌污染具有一定指導意義。

      發(fā)酵;種子;無菌室;操作;染菌;滅菌

      維生素C發(fā)酵屬于液體深層發(fā)酵,防止雜菌污染的工作尤為重要。特別是二步種子易被雜菌污染,導致周期延長,產(chǎn)量下降,嚴重影響發(fā)酵生產(chǎn)。科技書上指出:一般種子帶菌或懷疑種子帶菌占發(fā)酵染菌率的9.64%,居發(fā)酵污染概率的第三位[1]。懷疑而不能確認是由于確認的手段欠缺,光學鏡檢不能確認微米生物粒子的污染,種子是否在選育中已被溫和性噬菌體污染就更加難以確認。一旦出現(xiàn)種子染菌,要及時組織調(diào)查,根據(jù)鏡檢、無檢平皿、留樣情況,再結(jié)合操作人員的回憶分析,找出種子染菌的原因和可能性,采取有效手段彌補一切可能引起種子染菌的漏洞,有針對性地解決問題。

      1 種子染菌原因分析及防治

      造成種子染菌的原因錯綜復雜,通過仔細觀察和認真分析,歸納出以下幾個方面:(1)高溫高壓蒸汽滅菌不徹底;(2)紫外線滅菌不徹底;(3)無菌室的無菌條件不符合要求;(4)操作不當造成染菌;(5)設(shè)備以及其它原因引起的染菌。

      1.1 高溫高壓蒸汽滅菌操作中注意事項

      高溫高壓蒸汽滅菌是利用高壓蒸汽產(chǎn)生的高溫以及熱蒸汽的穿透力,使微生物細胞中的蛋白質(zhì)極易凝固變性,引起微生物的死亡,從而達到滅菌的目的[2]。

      高溫高壓蒸汽滅菌操作時應(yīng)注意以下幾點:(1)排盡滅菌器中的殘留空氣及蒸汽管道中的冷凝水,否則壓力表所顯示的壓力是水蒸汽和部分空氣壓力總和,不是水蒸汽的實際壓力,這時溫度與壓力不成比例,造成滅菌不徹底而且滅菌時間長。(2)在滅菌物品的簍子上粘貼蒸汽滅菌化學指示劑,觀察變色是否均勻,來證明滅菌是否徹底。注意化學滅菌指示劑貯存條件為室溫20℃,相對濕度50%以下,避免太陽光、熒光燈、紫外燈照射。(3)滅菌完畢后,壓力降為“0”時緩緩開門,不然會造成瓶內(nèi)的液體突然沸騰上升,將塞子頂出或沖濕,這樣極易染菌。

      實例一:操作人員使用蒸汽滅菌器對固體培養(yǎng)基滅菌后,將分裝固體培養(yǎng)基的平皿倒置培養(yǎng)1天后,部分平皿中的培養(yǎng)基上、中、下層都出現(xiàn)細小的白色顆粒,培養(yǎng)二三天后那些白色顆粒處陸續(xù)長出雜菌菌落,鏡檢是陽性芽孢桿菌。經(jīng)過觀察分析,懷疑那白色顆粒是部分瓊脂沒有化開,8瓶培養(yǎng)基中可能有2-3瓶消不透,說明蒸汽滅菌器內(nèi)溫度達不到規(guī)定溫度,且熱量不均勻。

      分析:(1)蒸汽滅菌器內(nèi)冷空氣未排盡;(2)蒸汽滅菌器的冷凝水排水不暢通。

      檢查:蒸汽滅菌器冷凝水排水管出口在底樓,有人用拖把堵在出汽口造成管道不暢通,拖把清理后,將進入滅菌器前的蒸汽管道內(nèi)冷凝水排放幾分鐘,然后開滅菌器進汽閥門,再將滅菌器內(nèi)冷凝水排放5分鐘以上,最后啟動滅菌器開始工作。從此再也沒有出現(xiàn)上述情況,說明判斷正確。

      結(jié)論:蒸汽滅菌器操作前必須排空蒸汽管道內(nèi)的冷凝水及冷空氣,再對物品進行滅菌,在滅菌過程中溫度與壓力成比例。一般蒸汽滅菌不徹底易染陽性芽孢桿菌。

      1.2 紫外線滅菌

      紫外線滅菌是因為紫外線引起細胞內(nèi)的核酸形成胸腺嘧啶二聚體,從而干擾核酸的復制造成細胞損傷,另外紫外線還可使空氣中的氧分子變成臭氧,也有殺菌作用[3]。紫外線對革蘭氏陰性菌、噬菌體最敏感,陽性菌次之,但對芽孢桿菌及霉菌孢子不容易殺死。由于紫外線穿透力極低,一般限于對無菌室內(nèi)空氣及物體表面的滅菌。紫外線長期使用后能量逐漸衰減,殺菌效果亦降低,所以,(1)一般紫外燈管照射2000h必須更換新的紫外燈管;(2)部分細菌具有光復活作用,開紫外燈時不要同時開日光燈;(3)因為紫外線不能穿透玻璃,紫外線燈管不能裝入照明燈罩(玻璃板)里面。

      1.3 無菌室的無菌條件要符合要求

      空調(diào)凈化系統(tǒng)是采用初效、中效、高效過濾器三級過濾,以獲得所需的大量無菌空氣,來保證無菌室“四度”符合要求,無菌室內(nèi)的無菌條件必須符合以下幾點要求:

      (1)無菌室必須符合GMP要求。(2)初效、中效、高效過濾器必須定期更換,每年對高效過濾器做泄漏檢查,確保高效過濾器檢測合格才能使用。(3)每天要數(shù)次巡回檢查空氣凈化系統(tǒng)的溫度、濕度、壓差等情況。溫度控制在20℃-22℃,相對濕度控制在55%-60%,壓差≥10Pa為宜。打掃無菌室出風口時一定記住恢復風閥原位,不然無菌室內(nèi)的壓差會發(fā)生變化。(4)定期對無菌室的沉降菌、塵埃粒子數(shù)、風速、浮游菌等進行環(huán)境監(jiān)測。根據(jù)環(huán)境監(jiān)測情況及時做好清潔、滅菌處理工作,確證無菌室的無菌條件都合格。如果監(jiān)測到有極少量≥5μm塵埃粒子數(shù),說明無菌室衛(wèi)生打掃不徹底。(5)定期用臭氧消毒器對無菌室內(nèi)空氣消毒,來減少空氣中的浮游菌。

      實例二:有一次月環(huán)境監(jiān)測各項數(shù)據(jù)正常,不久操作人員在4#層流罩下制備種液,種液鏡檢、無檢都不染菌,此種液上罐后,小罐終點留樣染菌,仔細查找原因發(fā)現(xiàn)是由于4#層流罩風速由原4.2m/s下降到2.6m/s(風速標準為大于3.0m/s),維修后未再出現(xiàn)以上問題。

      規(guī)定:必須不定期測風速,來了解空氣的流動速度是否達標。

      1.4 操作過程中認真操作及注意點

      操作人員首先要樹立無菌觀念,無菌室只是相對無菌,大自然中有無數(shù)塵埃粒子,人是帶菌者,必須保持個人衛(wèi)生,要勤用75%的酒精棉球?qū)﹄p手認真消毒;操作時要一絲不茍,盡量不講話、減少走動,嚴格按操作規(guī)程操作;要保持瓶壁外無種液培養(yǎng)基及菌液;移種過程塞子不可被培養(yǎng)基蘸濕;操作時碰到不潔物應(yīng)廢棄;發(fā)酵現(xiàn)場進行種液移種到小罐時,一定要在火焰范圍內(nèi)操作,這樣可減少操作時被雜菌污染的機會,同時要克服麻痹、僥幸心理。

      發(fā)酵現(xiàn)場消毒工、看罐工若不能正確地操作,都會誤導種液的無菌度。如:消毒工在消毒過程中滅菌不徹底以及誤將空氣過濾器的濾芯消化,看罐工操作時掉零磅、泡沫冒頂?shù)鹊仍斐尚」奕揪诓恢榈那闆r下都誤判為種子帶菌。

      實例三:G組的種液鏡檢,無檢平皿,留樣,發(fā)酵瓶24h、48h樣都不染菌,此種液接入218#小罐,小罐終點不染菌(這時菌種室鏡檢人員發(fā)現(xiàn)發(fā)酵瓶72h樣中有極少量的陽性桿菌,決定對G組種液停止供種),又接入228#中罐,中罐終點不染菌,再接入239#大罐,大罐培養(yǎng)32h時發(fā)現(xiàn)有少量的陽性桿菌,直到大罐發(fā)酵終點雜菌量不多,(發(fā)酵罐內(nèi)雜菌形態(tài)與G組發(fā)酵瓶72h染的雜菌形態(tài)相同)。

      分析:操作過程中有極少量的微生物掉入種液瓶中,不易被留樣到,只有通過幾次擴大培養(yǎng)才能發(fā)現(xiàn)。

      實例四:懷疑C組上批種液染菌,禁止上罐。為了趕進度,C組操作人員接種時用G組正在搖床上已培養(yǎng)22小時未做鏡檢的其中2只搖瓶培養(yǎng)液作為母種接種(僥幸心理認為不染菌)。C組合瓶后鏡檢正常,種液接入小罐生長正常,再接入中罐,中罐終點發(fā)現(xiàn)染少量陰性桿菌,反查小罐終點留樣中有極少量陰性桿菌,而G組10桶種液鏡檢正常上罐后,只有1只中罐培養(yǎng)16小時發(fā)現(xiàn)染陰性菌,其余都不染菌。

      分析:由于中罐C組、G組染的陰性菌的菌形一樣,懷疑G組在無菌室接種過程中可能只有2-3只搖瓶染有極少量陰性菌,恰好是從G組拿到C組的2只搖瓶可能就是其中的1-2只,由于陰性菌的數(shù)量極少,逃過了菌種室鏡檢人員的“眼睛”,C組種液經(jīng)過冷藏、再擴大培養(yǎng)后,雜菌在小罐培養(yǎng)后期就出現(xiàn)了。

      規(guī)定:不允許用未經(jīng)證實是無雜菌的種液作為母種擴大培養(yǎng)。

      1.5 如何避免設(shè)備及其它原因造成種子染菌

      (1)菌種生產(chǎn)設(shè)備狀況也影響種子無菌度。如:層流罩有漏點;臭氧消毒器失靈;搖瓶機轉(zhuǎn)速過快,沖程過大或搖瓶內(nèi)液體裝得太多,在搖瓶機上搖動時,液體濺到塞子上易引起染菌;恒溫培養(yǎng)箱的溫控要好,若失靈有時會誤判染菌,所以鏡檢人員要積累生產(chǎn)經(jīng)驗來增強判斷能力。(2)發(fā)酵現(xiàn)場設(shè)備的好壞也會影響種液的無菌度。如:罐體、管道上有沙眼(很難看出)、總空氣系統(tǒng)帶菌以及不明原因染菌的情況下都誤判為種子帶菌。(3)菌種生長必須有一個清潔的環(huán)境。潔凈區(qū)域墻壁、地面及設(shè)備都必須用消毒劑認真擦洗,空間采用消毒劑噴霧處理。消毒劑每月更換,防止產(chǎn)生耐藥菌株。(4)如果分離平皿染菌、茄瓶斜面染菌或種液染菌,立即將所有物品高溫滅菌倒入下水道,對所用設(shè)備和無菌室必須用消毒劑反復認真擦洗,空間噴霧消毒,并開紫外燈及臭氧滅菌。

      2 結(jié)語

      雜菌無孔不入,因此不能機械地孤立認為某種染菌現(xiàn)象必定是某一原因或渠道所致,應(yīng)當把染菌的時間、菌形和雜菌存在的環(huán)境等方面的情況聯(lián)系起來加以綜合分析,才能作出符合實際的正確判斷,從而采取相應(yīng)的有效措施,制服染菌??傊?,只要各級操作人員工作負責,設(shè)備完好,種子不帶菌,小罐染菌率會降至0。

      [1]陳代杰,朱寶泉,等.工業(yè)微生物菌種選育與發(fā)酵控制技術(shù)[M].上海:上海科學技術(shù)文獻出版社,1994.

      [2]林雅蘭,羅大珍,等.微生物學[M].北京:北京大學出版社,2011. [3]王宜磊,等.微生物學[M].北京:化學工業(yè)出版社,2010.

      Cause Analysisand Prevention of BacterialContam ination of Seed

      HE Jian-qing
      (Aland(Jiangsu)NutraceuticalCo.,Ltd.,JingjiangJiangsu214500,China)

      Bacterial contamination of seed affects fermentation production seriously,and canincrease costof production greatly.In this paper,Iw illanalysis the cause ofbacterialcontamination of seed of vitamin C during the preparation process,mattersneeding attention for operators atwork,andm isjudgmentof contaminated seed from some aspects as follows:sterilization,seed preparation environment,aseptic technique and equipment.Then Iw ill illustratemy view w ith some examples and give some advice for controlmeasures.Ithink this paperhave agreatsignificance to avoid and preventbacterial contam ination during the production.

      fermentation;seed;sterile room;operating;contam ination;sterilization

      Q93

      A

      1671-0142(2011)05-0076-03

      何鑒清(1964-),女,江蘇靖江人,工程師.

      (責任編輯 李冠楠)

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