吳 衍,熊 前

(公安部南昌警犬基地，江西 南昌 330100)

犬精液冷凍保存技術(shù)在犬種資源的保護、品種選育和加快育種進程等方面具有重要的作用。1780年，意大利生理學(xué)家Spmlanzani首次用犬進行人工授精(AI)試驗并取得成功。1959年，Seager首次報道了犬的凍精人工授精試驗成功。1965年Har rop和Bendor f等人以牛奶和卵黃-檸檬酸緩沖液稀釋犬精液，在5℃條件下精子存活了數(shù)天。1988年，Bat tista等比較了Tris稀釋液、Test稀釋液、乳糖稀釋液和Pipes稀釋液。從結(jié)果來看，無論存活率還是活力和存活時間Tris稀釋液都最好。之后，人們相繼建立了有關(guān)精液冷凍、品質(zhì)鑒定以及AI的一系列優(yōu)化參數(shù)。世界上一些發(fā)達國家的犬冷凍精液與AI研究研究起步早，目前已得到了廣泛應(yīng)用。美國養(yǎng)犬俱樂部(AKC)早在20世紀70年代即投入了大量的資金用于犬的冷凍精液和AI研究，并詳細制定了冷凍精液生產(chǎn)以及AI各主要環(huán)節(jié)的操作規(guī)程；同時規(guī)定，從1981年起，只有經(jīng)過AKC審驗合格的配種站才能提供犬的冷凍精液。

我國在這方面的研究起步較晚，目前尚處于試驗研究階段。1985年，潘壽文等對德國牧羊犬的凍精及人工授精進行研究，輸精9頭母犬，2頭懷孕，平均窩產(chǎn)仔2頭；1991年，王力波等對德國牧羊犬的凍精也獲成功，輸精5頭，4頭懷孕，平均窩產(chǎn)仔7頭；1994年，劉海軍等對德國牧羊犬凍精進行研究，結(jié)論為在最優(yōu)條件下，解凍后精子活力為0.47，復(fù)蘇率52.2%，存活時間8.23 h，存活指數(shù)1.08，頂體完整率43%。

從國內(nèi)外研究者的結(jié)果來看，犬精子冷凍保存的效果不是很好，凍后活力一般在0.4左右，用凍精人工授精后受孕率低，產(chǎn)仔數(shù)少，給犬人工授精技術(shù)的推廣帶來很大的困難。為了提高冷凍精液的品質(zhì)和受胎率，許多研究者就稀釋液中的添加物進行了大量研究，不同程度影響到冷凍精液的品質(zhì)和受胎率。早期經(jīng)典的犬科動物凍精稀釋基液有多種，例如脫脂奶乳、Tris等，目前最普遍使用的一種稀釋液是添加適量果糖或者葡萄糖以及20%體積蛋黃的Tris-檸檬酸緩沖液。近年來，人們也常用經(jīng)濟、方便的椰子汁來替代傳統(tǒng)的稀釋液進行精液冷凍試驗。各種商品化的稀釋液也陸續(xù)在市場上出現(xiàn)并得到人們的認可，如德國Tiefenbach基于Tr is的Tri ladyl，美國Pennsylvania的C.L.O.N.E.。

1 犬冷凍精液稀釋液的pH值

由于精子代謝很強烈，能量消耗快，同時因代謝產(chǎn)物積累，改變了精子環(huán)境的pH值，導(dǎo)致某些酶的活性被抑制，致使精子喪失受精能力。因此，稀釋液pH值一定要控制在一定范圍。國內(nèi)外學(xué)者已對此作了大量研究，精液pH值可因精子代謝及其他原因而變化，當(dāng)精液pH值降低時，精子代謝與活動減弱；反之，因pH值上升，精子代謝與活動增強，能量迅速耗竭，存活時間減少。為維持正常代謝活動，精子需要適宜的pH值范圍，犬精子適宜的pH值范圍是6.4～7.0。部分國外學(xué)者認為最佳pH是6.6，國內(nèi)部分學(xué)者在配制精液稀釋液時對pH值未加調(diào)整，這是造成了精子凍后活力降低的重要因素。辛國省等通過對藏獒精液低溫保存稀釋液的pH值研究認為,犬的精液低溫保存稀釋液的最適pH為6.5。

2 質(zhì)膜保護劑

卵黃在低溫保存精液的冷卻過程中是一類很好的防精子冷休克的物質(zhì),可以使精子質(zhì)膜在冷凍過程中損壞的磷脂得以修復(fù)。同時，卵黃還是一種滲透性緩沖劑, 使精子能耐受低滲和高滲脅迫。所以，稀釋液中經(jīng)常添加蛋黃來作為精子質(zhì)膜的保護劑，其濃度隨緩沖液中其它組成成分不同而不同。但是蛋黃的應(yīng)用可以引起病原體的廣泛傳播。隨著犬冷凍精液進入國際市場，人們也在尋找卵黃的替代品。抗氧化劑二叔丁對甲酚(BHT)類物質(zhì)在牛的精子冷凍中對精子質(zhì)膜具有很好的保護性,但在犬科動物中尚需進一步研究。

3 冷凍保護劑

保存過程中，精子經(jīng)歷了降溫、凍結(jié)、解凍過程，其中冰晶形成不可避免地損傷了精子(李青旺等，2003)。由于冰晶會導(dǎo)致類脂蛋白變性，破壞細胞膜相結(jié)構(gòu)、產(chǎn)生機械損傷，導(dǎo)致精子超微結(jié)構(gòu)破壞、頂體物質(zhì)流失、頂體膜脫落等(Oehninger等，2000)。因此，有效降低大冰晶形成方法就是使用冷凍保護劑。理想的冷凍保護劑應(yīng)該具有3方面的特征，即可以快速滲入精子細胞內(nèi)，對溫度依賴性低，對精子毒性小。常用的冷凍保護劑有甘油、乙二醇、DMSO等。其中甘油應(yīng)用最早，其有利于電解質(zhì)和水結(jié)合，使精子內(nèi)含水蛋白穩(wěn)定,減少冷凍時細胞內(nèi)冰晶的形成，降低對精子的損傷。保護劑有毒性作用，引起精子超微結(jié)構(gòu)的明顯損害。隨著保護劑濃度的升高，其對精子的毒性作用亦隨之增強，冷凍精子復(fù)蘇率會呈下降趨勢。乙二醇與甘油相比不僅具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，而且分子量較小，所以具有更高的滲透性，在人、小鼠等的精子冷凍試驗中乙二醇都有比甘油更好的保護效果。但在犬科動物中，其效果有很大的差異。Cavalcanti等的試驗表明，相對于甘油，在含有相同濃度乙二醇的稀釋液中，解凍后的精子活率偏低；Soares等發(fā)現(xiàn)，0.25、0.50mol/L的乙二醇與0.80mol/L的精子活率的影響沒有顯著差異，但是精子在含1.0mol/L的乙二醇的稀釋液中解凍后的活率相對于前者有很大程度的降低；張志平等對甘油和乙二醇濃度進行了比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4%甘油對犬精子冷凍效果較好，而且優(yōu)于用5%乙二醇。Mar tins等(2006)也報道相似結(jié)論。最近，Rota等用低滲膨脹法分別測定了5%濃度的乙二醇和甘油對精子解凍后的活力和質(zhì)膜完整性，結(jié)果顯示乙二醇可以使解凍后短期內(nèi)(1～3 h)的精子具有極高的活率和很完整的質(zhì)膜。

在冷凍稀釋液里加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉(SDS)也可以提高犬解凍精子的活率和存活時間。目前商品化的SDS類冷凍稀釋液最常用的有Equex STM Paste和Orvus ES Paste兩種，并且對提高解凍后精子的活率都有很好的效果。Equex Paste也偶爾見于文獻，但普遍沒有發(fā)現(xiàn)明顯提高精液品質(zhì)的作用。Pena等推測SDS對解凍后精子的作用可能與細胞內(nèi)Ca2+濃度有關(guān)。

4 低溫保存犬精液稀釋液的能量物質(zhì)

糖類物質(zhì)不僅可以作為保護劑保持稀釋液的滲透壓，而且可以在冷凍過程中為犬精子提供代謝所需要的能量。果糖和葡萄糖是目前最常用的兩種糖，但是，文獻中這兩種糖在稀釋液中的濃度從5mmol/L到120mmol/L不等。Ponglowhapan等的研究結(jié)果顯示，在卵黃一Tr is稀釋液中，70mmol/L的果糖對精子的冷凍儲藏效果最好，但是相對于果糖，犬精子更傾向于消耗同濃度條件下的葡萄糖。

5 其他

Michael等研究了添加抗氧化劑對解凍后精子活率的影響,結(jié)果表明在稀釋液中分別添加維生素C(1.5mmol/L)、乙酰半胱氨酸(1.5mmol/L)、牛磺酸(0.6mmol/L)、過氧化氫酶(300 U/mL)等可以不同程度地增強解凍后精子的活率，但是最佳濃度還需進一步優(yōu)化。

精液和稀釋液都是營養(yǎng)豐富的物質(zhì)，是細菌微生物孳生的適宜環(huán)境。有研究表明，未發(fā)現(xiàn)細菌的精液其保存效果非常好，在有細菌的精液，其保存性因細菌的種類和數(shù)量不同而異，并且指出大腸桿菌等對精液保存影響極大，可在短時間內(nèi)使精子活力、頂體完整率大幅度下降，青霉素、鏈霉素等抗菌物質(zhì)能抑制細菌的孳生。