新疆塔城地區(qū)仔豬黃白痢病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

周 軍

（新疆塔城地區(qū)畜牧科技研究推廣中心，新疆塔城市 834700）

隨著肉食品價(jià)格的不斷升高、國(guó)家鼓勵(lì)政策的實(shí)施，養(yǎng)豬業(yè)得到了迅速發(fā)展，規(guī)模養(yǎng)殖不斷擴(kuò)大，而困擾養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的豬病問(wèn)題（如仔豬黃白?。┯葹橥怀?。仔豬黃白痢發(fā)病率高、死亡率高，嚴(yán)重威脅養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，對(duì)其研究已成為世界性的重要課題。加之，近年來(lái)由于濫用抗生素，使得細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生，在規(guī)?；B(yǎng)殖的情況下藥物治療也十分困難。

為調(diào)查塔城地區(qū)仔豬黃白痢發(fā)病和流行情況，指導(dǎo)養(yǎng)豬場(chǎng)用藥，更好的從源頭預(yù)防控制仔豬黃白痢的發(fā)生，筆者對(duì)塔城地區(qū)的仔豬黃白痢病料中的致病菌進(jìn)行了分離鑒定，同時(shí)做了藥敏試驗(yàn)。

1 材料

1.1 病料

病料為死亡仔豬腸內(nèi)容物，來(lái)自塔城市、額敏縣、沙灣縣30家規(guī)模較大的養(yǎng)豬場(chǎng)。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

鮮血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、SS瓊脂平板、伊紅美藍(lán)瓊脂平板、普通瓊脂平板；MR試劑、VP試劑、吲哚試劑、過(guò)氧化氫試劑、K88陽(yáng)性血清、氧化酶試劑等。

1.3 藥敏紙片

由北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康小白鼠40只，體重17～24 g，雌雄各半。

1.5 紅細(xì)胞的制備

分別采集健康豬、綿羊、雞、兔和豚鼠動(dòng)物血液，5%的檸檬酸鈉抗凝，2000轉(zhuǎn)/分鐘 離心，生理鹽水洗滌細(xì)胞，如此3次，每次10分鐘，最后用0.0l mol/L PBS(pH 7.2)稀釋到1%的工作濃度。

1.6 主要器材

全自動(dòng)鑒定及藥敏測(cè)試儀（ATB Expression）、離心機(jī)、GMSX-280手提式壓力蒸汽消毒器、數(shù)碼顯微鏡、溫箱、冰箱、SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)。

2 方法

2.1 病原分離

將采集的病料接種于EC增菌液，37℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)，轉(zhuǎn)入鮮血培養(yǎng)基37℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)，再將分離純化的菌株，接種于麥康凱瓊脂平板、SS瓊脂平板、伊紅美藍(lán)瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)，觀察分離細(xì)菌生長(zhǎng)的菌落特點(diǎn)，同時(shí)將分離菌抹片，革蘭氏染色，鏡檢。

2.2 用細(xì)菌鑒定儀鑒定

隨機(jī)每縣市選取一株細(xì)菌分別進(jìn)行鑒定。從山梨醇麥康凱瓊脂平板取1～2個(gè)純化的菌落，用生理鹽水稀釋到0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?，取?xì)菌菌液200 μL接種于液體培養(yǎng)基，混勻；用連續(xù)加樣器將帶有細(xì)菌的培養(yǎng)基，分別加入鑒定條的32個(gè)孔，每孔135 μL，蓋好鑒定條的蓋子，放入溫箱30℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)。打開蓋子，用細(xì)菌鑒定儀鑒定。

2.3 生化試驗(yàn)

常規(guī)生化試驗(yàn)，37℃恒溫培養(yǎng)72小時(shí)，觀察記錄結(jié)果（見表1）。

2.4 用血凝方法鑒定其K抗原血清型

原理：K88不能凝集綿羊紅細(xì)胞，但能凝集雞、豬、豚鼠、兔的紅細(xì)胞；K99株不能凝集兔的紅細(xì)胞，但能凝集雞、豬、豚鼠、綿羊的紅細(xì)胞；987p全部不凝集；F41全部凝集。當(dāng)大腸桿菌菌毛粘附于各種動(dòng)物紅細(xì)胞上時(shí)，能使紅細(xì)胞發(fā)生凝集，且不被D-甘露糖抑制，系一種甘露糖抵抗血凝反應(yīng)(MRHA)。

菌毛的制備：分別將30株培養(yǎng)好的細(xì)菌用0.01 mol/L pH 7.2的PBS洗滌并轉(zhuǎn)移到20 mL滅菌離心管中，8000轉(zhuǎn)/分鐘 離心15分鐘，稱取細(xì)菌細(xì)胞的濕重，以0.1 g/mL濕重菌量懸浮于0.01 mol/L pH 7.2的PBS緩沖液中，60℃水浴振搖30分鐘脫菌毛，經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分鐘 4℃離心15分鐘，吸取上清液20 mL置磁力攪拌器上緩慢加入研細(xì)的(NH4)2SO4（終濃度為30%），邊加邊攪拌，待 (NH4)2SO4完全溶解后，置4℃冰箱過(guò)夜，4℃15000轉(zhuǎn)/分鐘 離心40分鐘，沉淀溶于2 mL 0.01 mol/L的PBS中備用。

鑒定方法：先做血凝預(yù)試驗(yàn)，以能明顯凝集紅細(xì)胞供試液的最高稀釋倍數(shù)作為該黏附素抗原的血凝效價(jià)。取96孔板每孔加入50μL含1%D-甘露糖的PBS液（共31行5列），前30行每孔加入50 μL菌毛提取液第31行每孔加入 50 μL含 1%D-甘露糖的 PBS液做對(duì)照，1～5列依次加入1%的豬紅細(xì)胞、1%的綿羊紅細(xì)胞、1%的雞紅細(xì)胞、1%的兔紅細(xì)胞和1%的豚鼠紅細(xì)胞液50 μL，放微量震蕩器上震蕩2分鐘，然后放到4℃冰箱，3小時(shí)后觀察結(jié)果。

2.5 致病性試驗(yàn)

將小白鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，即塔城市、額敏縣、沙灣縣及對(duì)照組。將分離到的各菌株腹腔注射，每只小鼠3×108CFU的菌液，對(duì)照組注射生理鹽水0.2 mL/只，觀察接種菌液后72小時(shí)內(nèi)小白鼠死亡情況，并將死亡小白鼠的心、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、血液接種于鮮血瓊脂平板上，37℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)，抹片、染色、鏡檢，觀察是否為接種菌株。

表1 30株細(xì)菌的生化培養(yǎng)的結(jié)果

表2 K抗原鑒定結(jié)果

表3 30株細(xì)菌人工感染小白鼠致死的結(jié)果

2.6 藥敏試驗(yàn)

將分離的菌株（30株都進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，由于結(jié)果大致相同，所以只選擇塔城市、額敏縣、沙灣縣各一株的數(shù)據(jù)列入表中）接種于麥康凱平板上，貼上藥敏紙片（20種藥物），37℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)，觀察抑菌圈直徑。

3 結(jié)果及分析

3.1 細(xì)菌鑒定儀鑒定結(jié)果

三株（塔城市、額敏縣、沙灣縣各選一株）均為大腸桿菌。

3.2 分離細(xì)菌的培養(yǎng)特性、形態(tài)特征

從病料中采集、分離到的30株細(xì)菌，培養(yǎng)特性基本一致。在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，生長(zhǎng)菌落呈圓形、濕潤(rùn)、表面光滑、邊緣整齊、乳白色小菌落，接種在麥康凱瓊脂平板上呈粉紅色圓形菌落；在SS瓊脂上呈圓形深紅色菌落，在伊紅美藍(lán)瓊脂上產(chǎn)生黑色帶金屬閃光的菌落。革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性小桿菌。其培養(yǎng)特性和外觀與大腸桿菌最為相似，初步鑒定為大腸桿菌。

3.3 生化試驗(yàn)的結(jié)果

30株細(xì)菌的生化培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相同，但有量的差異，見表1。其生化特性均符合大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)，可判定為大腸桿菌。

3.4 血凝試驗(yàn)K抗原鑒定結(jié)果

凡是5種紅細(xì)胞都不凝集的，為987p（由于這30株細(xì)菌在提取菌毛和做血凝試驗(yàn)時(shí)，所有的操作是完全相同的，所以由于沒有提取到菌毛而與5種紅細(xì)胞不凝集的可能性幾乎沒有），見表2。

3.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

塔城市、額敏縣、沙灣縣所分離到的細(xì)菌均有致病性，毒力強(qiáng)弱順序?yàn)轭~敏縣＞沙灣縣＞塔城市，見表3。

3.6 藥敏試驗(yàn)的結(jié)果

塔城市的菌株除了對(duì)慶大霉素、頭孢曲松敏感，對(duì)痢特靈中度敏感外，對(duì)其他藥物全部耐藥；建議塔城市的豬場(chǎng)治療用藥時(shí)選用慶大霉素、頭孢曲松。

額敏縣的菌株除了對(duì)慶大霉素、頭孢曲松敏感，對(duì)氟哌酸中度敏感外對(duì)其他藥物全部耐藥；建議額敏縣的豬場(chǎng)治療用藥時(shí)選用慶大霉素、頭孢曲松。

沙灣縣的菌株除了對(duì)慶大霉素、痢特靈敏感，對(duì)氟哌酸中度敏感外，對(duì)其他藥物全部耐藥；建議沙灣縣的豬場(chǎng)治療用藥時(shí)選用慶大霉素、痢特靈?？傊?，三個(gè)縣市分離到的菌株均對(duì)慶大霉素敏感。建議養(yǎng)豬場(chǎng)（戶）交叉用藥，防止細(xì)菌耐藥菌的產(chǎn)生（見表4）。

表4 藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù)表