厚華艷,朱春紅,孟 霞,朱國(guó)強(qiáng)*
(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009;2.江蘇省家禽科學(xué)研究所,江蘇揚(yáng)州 225125)
腸炎沙門氏菌SEF14菌毛研究進(jìn)展
厚華艷1,朱春紅2,孟 霞1,朱國(guó)強(qiáng)1*
(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009;2.江蘇省家禽科學(xué)研究所,江蘇揚(yáng)州 225125)
Feutrier等1986年首次在臨床分離的一株人源腸炎沙門氏菌中發(fā)現(xiàn)一種菌毛(后來被稱為SEF14菌毛),具有甘露糖敏感血凝反應(yīng)(MSHA),形態(tài)上與腸桿菌科細(xì)菌的Ⅰ型菌毛難以分辨,蛋白質(zhì)亞單位為14.4 kD,比傷寒沙門氏菌Ⅰ型菌毛亞單位(22.1 kD)小,N-末端18個(gè)氨基酸殘基與大腸桿菌和傷寒沙門氏菌Ⅰ型菌毛同源[1]。Müller等在同一株人源腸炎沙門氏菌分離株上鑒定了甘露糖敏感且形態(tài)和生化特性上不同于之前報(bào)道的SEF14的典型Ⅰ型菌毛[2]。1990年Tahorns等通過單克隆抗體(MAb)介導(dǎo)方法在腸炎沙門氏菌表面鑒定出這一菌毛樣結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)亞單位為14.3 kD,直徑小于5 nm,沒有凝集紅細(xì)胞能力[3]。目前已有的研究表明:SEF14蛋白亞基基因sefA主要分布于D血清型沙門氏菌中,但SEF14抗原只表達(dá)于都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、莫斯科沙門氏菌和布利丹沙門氏菌菌體表面[4-5]。根據(jù)其凝集紅細(xì)胞能力和形態(tài)大小的差異,而且與已經(jīng)鑒定的其他菌毛蛋白沒有同源性,所以不能夠歸于現(xiàn)有的沙門氏菌菌毛中任何一類[6]。
sef基因操縱子位于一個(gè)小致病毒力島,主要由sefA、sefB、sefC、sefD4個(gè)結(jié)構(gòu)基因編碼蛋白完成SEF14菌毛的合成和組裝(圖1),sefA編碼主要蛋白亞基,sefB和sefC分別編碼伴侶蛋白和推進(jìn)蛋白,sefD編碼菌毛的頂端粘附素,位于SEF14菌毛結(jié)構(gòu)頂端[7-8]。sefB編碼菌毛周質(zhì)伴侶蛋白,與大腸桿菌菌毛周質(zhì)伴侶蛋白同源,在周間隙中與菌毛蛋白亞基SEFA結(jié)合,避免其前體非活性聚集;SefC蛋白與大腸桿菌菌毛外膜蛋白同源,促使伴侶蛋白SefB與菌毛蛋白亞基或菌毛蛋白前體解離;sefR是緊連sefD的一個(gè)反向調(diào)節(jié)基因[9-11]。Clouthier和Edwards等認(rèn)為sefABCD操縱子基因作為一個(gè)整體同時(shí)轉(zhuǎn)錄和翻譯,在sefA上游有兩個(gè)主要轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),sefBC的轉(zhuǎn)錄也要從sefA的啟動(dòng)子區(qū)起始,在sefA極性(polar)突變株中sefB、sefC和sefD均不能轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[7-9]。如圖2所示,在SEF14菌毛亞單位突變株△sefA中,亞單位SEFD能夠以菌毛類似物表達(dá)于菌體表面(圖2B),但在突變株△sefD中,亞單位SEFA則不能表達(dá)展呈于菌體表面(圖2D),依此推測(cè)次要亞單位SEFD是通過主要亞單位SEFA結(jié)合伴侶蛋白和推進(jìn)蛋白并成功通過細(xì)胞周間隙,表達(dá)于菌體表面,和亞單位SEFA組裝成成熟SEF14菌毛。但sefA基因的極性突變株無任何亞單位表達(dá)于菌體表面(圖2C)。SEF14菌毛是一個(gè)典型的經(jīng)伴侶蛋白-推進(jìn)蛋白途徑分泌的蛋白。通常情況下,伴侶蛋白、推進(jìn)蛋白兩個(gè)輔助蛋白參與其中作用,菌毛蛋白結(jié)構(gòu)亞單位在細(xì)胞周質(zhì)中與伴侶蛋白結(jié)合以避免非活性形式的聚集或者被相關(guān)蛋白酶降解;然后在推進(jìn)蛋白的作用下穿過外膜蛋白,表達(dá)于細(xì)菌表面并完成組裝[12]。
朱春紅等利用PCR擴(kuò)增方法檢測(cè)了18株雞白痢沙門氏菌、11株腸炎沙門氏菌以及1株都柏林沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株中sefA、sefD和sefR基因序列,結(jié)果表明以11株腸炎沙門氏菌及1株都柏林沙門氏菌染色體DNA為模板能夠擴(kuò)增sefA、sefD以及sefR基因,以18株雞白痢沙門氏菌染色體DNA為模板能夠擴(kuò)增sefA基因,但只有分離于1980年之前的7株分離菌能夠成功擴(kuò)增sefD和sefR基因,而另11株1980年后分離菌PCR擴(kuò)增sefD和sefR基因均為陰性。據(jù)此認(rèn)為SEF14菌毛操縱子亞單位基因sefA、sefD以及調(diào)節(jié)基因sefR在不同沙門氏菌中的變異情況可能是SEF14菌毛局限性表達(dá)的原因之一[13]。
圖1 腸炎沙門氏菌sef14基因結(jié)構(gòu)圖(Edwards,2000)Fig.1 Thesef14gene cluster ofS.enteritidis
圖2 腸炎沙門氏菌SEF14菌毛可能的分泌表達(dá)機(jī)制(Edwards,2000)Fig.2 Predicted export of SEF14 fimbriae subunits from periplasm in different mutants
sef基因操縱子的表達(dá)受細(xì)菌生長(zhǎng)周期、環(huán)境因素、調(diào)控因子等多方面因素的調(diào)控。Walker等利用特異性檢測(cè)SEF14菌毛的ELISA試驗(yàn),研究4株不同的腸炎沙門氏菌在肉湯培養(yǎng)和平板培養(yǎng)條件下,SEF14菌毛表達(dá)的合適溫度和pH條件,至少3個(gè)環(huán)境因素影響SEF14菌毛表達(dá):溫度、pH、細(xì)菌之間的關(guān)聯(lián)性,在pH呈酸性,溫度為37℃時(shí),更利于SEF14菌毛表達(dá)[14]。sef基因操縱子表達(dá)還受調(diào)控因子RpoS的調(diào)控,但RpoS對(duì)sef操縱子的調(diào)控是直接的還是間接的目前還不確定[6]。本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化腸炎沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株50336 SEF14菌毛表達(dá)最佳條件為:接種標(biāo)準(zhǔn)株50336單菌落于TSB培養(yǎng)基中,25℃搖床培養(yǎng)24 h,次日按1∶100轉(zhuǎn)接到新的TSB培養(yǎng)基中,20℃搖床培養(yǎng) 24 h,第 3 d按 1∶50轉(zhuǎn)接到 CFA(pH6.0)培養(yǎng)基中,37℃靜置培養(yǎng)50 h~60 h。此外還發(fā)現(xiàn)經(jīng)萘啶酮酸誘導(dǎo)的缺失株△sefA與野生株相比,在20℃時(shí)生長(zhǎng)極緩慢(未發(fā)表實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù))。
菌毛在細(xì)菌和宿主細(xì)胞之間相互作用中發(fā)揮重要毒力作用[15]。特定菌毛在腸道細(xì)菌中的分布可能與其致病性有密切關(guān)系,如廣泛分布于革蘭氏陰性菌中的Ⅰ型菌毛,介導(dǎo)病原菌與宿主如咽喉部,腸道上皮或者膀胱上皮組織之間的黏附;但細(xì)菌中同時(shí)也存在著這樣一類菌毛結(jié)構(gòu),他們限制性分布于某些特定的細(xì)菌,比如只在沙門氏菌中發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒編碼的菌毛結(jié)構(gòu)(PEF),則介導(dǎo)沙門氏菌特異性黏附于宿主腸道的M細(xì)胞。SEF14菌毛有限分布于腸炎沙門氏菌和相近的D群沙門氏菌中[7]。
Edward等通過構(gòu)建sefA和sefD突變株研究SEF14菌毛功能,sef操縱子極性突變株對(duì)小鼠毒力下降為1∶1 000倍,而sefA非極性突變株的毒力無明顯變化,但sefD突變株毒力顯著降低。表明SEF14菌毛次要亞單位黏附素sefD對(duì)于SEF14菌毛的毒力是必要的[7]。最新研究顯示,野生株中sefD基因在42℃時(shí)轉(zhuǎn)錄被抑制,而缺失sefD基因的回補(bǔ)株中sefD基因的轉(zhuǎn)錄量為野生株的103倍,但回補(bǔ)株的生長(zhǎng)卻受到了抑制,野生株和缺失株感染雞的血鈣和產(chǎn)蛋量下降,但感染回補(bǔ)株的雞這種現(xiàn)象。表明sefD基因突變株或者在雞的高體溫下抑制sefD基因表達(dá)的野生株均通過產(chǎn)生不同代謝物來促進(jìn)腸炎沙門氏菌的毒力[16]。
Thorns等曾報(bào)道SEF14菌毛突變株與相應(yīng)野生株相比更快被人中性粒細(xì)胞吞噬[17]。Edward等的研究顯示,sefD突變株與野生株相比在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的存活率下降,他認(rèn)為SEF14菌毛能夠使腸炎沙門氏菌在巨噬細(xì)胞中有效存活[7]。本實(shí)驗(yàn)室利用Red同源重組構(gòu)建了SEF14菌毛突變株,并用野生株、突變株對(duì)腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2和人結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2進(jìn)行了粘附實(shí)驗(yàn),小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬作用和野生株以及相應(yīng)突變株在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活作用。初步結(jié)果表明野生株及相應(yīng)突變株對(duì)上皮細(xì)胞及腸道細(xì)胞的粘附數(shù)量差異不顯著,SEF14菌毛并不特異性介導(dǎo)腸炎沙門氏菌與腸上皮細(xì)胞的粘附作用,或者不是粘附的主要作用因子,小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)和存活試驗(yàn)結(jié)果表明:活化的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)突變株吞噬作用增強(qiáng),借助SEF14菌毛的作用,腸炎沙門氏菌能更好的作用于巨噬細(xì)胞并在巨噬細(xì)胞中存活,利于其隱性感染和長(zhǎng)期排毒(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。
關(guān)于其在易感動(dòng)物體內(nèi)的致病力情況,Thorns報(bào)道SEF14菌毛突變株和野生株相比在腸道的定殖、對(duì)一日齡雛雞、產(chǎn)蛋雞及BALb/c小鼠的侵襲和系統(tǒng)性的傳播差異不顯著[17]。Rajasekara等證明,與野生株相比,SEF14菌毛突變株在其感染雞的肝、脾中幾乎分離不到感染菌[18]。Dibb-Fuller、Thorns和Ogunniyi等認(rèn)為SEF14菌毛對(duì)侵襲作用沒有影響[19-20]。有趣的是,Thiagarajan發(fā)現(xiàn)SEF14菌毛在雞中與經(jīng)卵巢傳播有關(guān)[21]。也有人認(rèn)為SEF14菌毛單個(gè)毒力因子在腸炎沙門氏菌致病性中并未發(fā)揮主要毒力作用,可能與其他毒力因子協(xié)同發(fā)揮作用,或者是感染的宿主不同,發(fā)揮作用也不同[16]。目前為止,關(guān)于SEF14菌毛的功能存在很大爭(zhēng)議。
研究表明腸炎沙門氏菌的鞭毛蛋白、孔蛋白、外膜蛋白、SEF14和SEF21菌毛蛋白均具有免疫原性,可以作為抗原免疫動(dòng)物并提供有效的免疫保護(hù)作用[22]。以SEF14和SEF21菌毛作為抗原,脂質(zhì)體為免疫佐劑,點(diǎn)眼法免疫家禽,能夠產(chǎn)生系統(tǒng)性和粘膜免疫反應(yīng),在免疫家禽的腸道和血清中能夠檢測(cè)到抗體IgA和IgG,同時(shí)降低了腸炎沙門氏菌在腸道中的定殖和糞便中的排菌[23]。Lopes等重組表達(dá)腸炎沙門氏菌SEF14菌毛亞單位蛋白SEFA,并將其導(dǎo)入無致病性、無毒的大腸桿菌中,免疫1日齡雞,產(chǎn)生抗SEFA蛋白的特異性免疫反應(yīng),可以在免疫家禽的腸道和膽汁中檢測(cè)到抗SEFA的抗體IgA[24]??辜?xì)菌感染的免疫保護(hù)作用通常是由多種抗原協(xié)同參與完成,單一抗原或抗原亞單位不能對(duì)宿主提供足夠的保護(hù)。Aslanzadeh等的研究表明腸炎沙門氏菌SEF21、SEF17和SEF14菌毛的聯(lián)合免疫可產(chǎn)生更好的免疫效果[25]。
目前,由腸炎沙門氏菌引起的食物中毒事件繁多,特別是西方發(fā)達(dá)國(guó)家,造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失,大多是因?yàn)槭秤昧四c炎沙門氏菌污染的肉蛋產(chǎn)品,因此快速、準(zhǔn)確、特異性診斷腸炎沙門氏菌的方法尤為重要。鑒于SEF14菌毛免疫原性,將其制成顆??乖?,用于檢測(cè)抗腸炎沙門氏菌SEF14菌毛特異性抗體,在第二次乳膠凝集試驗(yàn)中根據(jù)鞭毛抗原上的特異位點(diǎn)可以將其與都柏林沙門氏菌區(qū)別開來[5,26]。該方法比較理想,但價(jià)格昂貴。此外,SEF14菌毛主要亞單位基因sefA主要分布于D群沙門氏菌中,根據(jù)sefA基因設(shè)計(jì)的PCR檢測(cè)方法一定程度上可特異性檢測(cè)D群沙門氏菌的感染[27]。Thorns等建立了SEF14-DAS ELISA能夠?qū)⒛c炎沙門氏菌感染與其他沙門氏菌如雞白痢沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌等的感染區(qū)分開[28]。
本實(shí)驗(yàn)室利用SEF14菌毛的限制性表達(dá)特性建立了腸炎沙門氏菌的特異性診斷方法:朱春紅建立和優(yōu)化了重組亞單位蛋白rSEFA介導(dǎo)的間接ELISA方法特異性檢測(cè)腸炎沙門氏菌血清抗體。該間接ELISA具有較好的特異性,能特異性識(shí)別腸炎沙門氏菌和都柏林沙門氏菌感染血清,不能識(shí)別相近的雞白痢沙門氏菌感染血清[29]。段曉麗利用制備的抗SEF14菌毛MAb建立了雙抗體夾心間接ELISA方法。該方法以MAb作為捕獲抗體包被酶標(biāo)板,以抗SEF14菌毛的雞血清為檢測(cè)抗體,該雙抗體夾心間接ELISA方法特異性更強(qiáng),靈敏性更高,對(duì)腸炎沙門氏菌特異性抗體檢測(cè)有潛在的應(yīng)用前景[30]。
鑒于腸炎沙門氏菌SEF14菌毛的免疫原性和亞單位蛋白基因sefA的特異性分布,在建立新型診斷技術(shù)方面和未來研制基因工程疫苗方面具有廣闊應(yīng)用前景。目前為止,關(guān)于SEF14菌毛的致病機(jī)理和免疫機(jī)理存在很大爭(zhēng)議,但隨著分子生物學(xué)研究技術(shù)的不斷發(fā)展,SEF14菌毛的結(jié)構(gòu)和功能研究也在不斷深入,相信在腸炎沙門氏菌感染特異性檢測(cè)與預(yù)防控制方面定會(huì)發(fā)揮重要作用。
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S852.61
B
1008-0589(2013)10-0855-04
10.3969/j.issn.1008-0589.2013.10.20
*Correspondingauthor
2012-02-16
國(guó)家自然科學(xué)基金(31101833、31101826、31270171);江蘇省自然科學(xué)基金(SBK201122944);國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2012BAK17B10);教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(IRT0978);江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目;揚(yáng)州市農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(YZ2011066)
厚華艷(1987-),女,內(nèi)蒙古赤峰人,碩士研究生,主要從事病原微生物致病機(jī)理及免疫機(jī)理研究.
*通信作者:E-mail:yzgqzhu@hotmail.com;yzgqzhu@yzu.edu.cn
(本文編輯:趙曉巖)