吳昌標(biāo) 林 平 鄭文金

（1.福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福州 350119；

2.福建農(nóng)林大學(xué)，福州 350002；

3.福清市文華實(shí)業(yè)有限公司，福清 350303；

4.莆田市金日興生物科技有限公司，莆田 351100）

1 引言

雞球蟲(chóng)?。ˋvian coccidiosis）是集約化養(yǎng)雞業(yè)多發(fā)、危害嚴(yán)重且防治困難的寄生蟲(chóng)病之一，造成的經(jīng)濟(jì)損失十分巨大[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，包括防治該病所花的藥費(fèi)在內(nèi)，全球每年損失約80億美元[3]。在我國(guó)，每年花在球蟲(chóng)病預(yù)防方面的費(fèi)用達(dá)到10～20億元人民幣，成為現(xiàn)代化集約式家禽養(yǎng)殖業(yè)中最耗資的疾病。

傳統(tǒng)上，防治雞球蟲(chóng)病主要采取飼料中添加化學(xué)藥物的方法，這些藥物可以阻斷球蟲(chóng)生活史從而達(dá)到控制球蟲(chóng)病的目的[4]。雖然持續(xù)化學(xué)藥物添加已被證明對(duì)集約化雞場(chǎng)防治球蟲(chóng)病有很高的效果[5-6]，然而化學(xué)藥物在治療雞球蟲(chóng)病的同時(shí)對(duì)動(dòng)物機(jī)體有不同程度的副作用，且在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)有不同程度的殘留，危害人類(lèi)健康、污染環(huán)境[7]。用疫苗控制球蟲(chóng)病和藥物防治相比，不僅經(jīng)濟(jì)、有效，節(jié)省勞動(dòng)力，生產(chǎn)性能好，而且可以最大限度滿足消費(fèi)者對(duì)綠色食品的關(guān)注，已成為防治雞球蟲(chóng)病較好的技術(shù)手段[4]。國(guó)內(nèi)外一些單位開(kāi)展了雞球蟲(chóng)病免疫預(yù)防研究，取得了一定的成效，如中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)、廣西大學(xué)和新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位相繼通過(guò)雞球蟲(chóng)早熟系等方法的選育獲得了免疫原性好、致病性低的球蟲(chóng)蟲(chóng)株，用于雞球蟲(chóng)病的免疫預(yù)防，獲得了良好的效果[8-9]。

為了探索福建省莆田市雞球蟲(chóng)病免疫預(yù)防的方法，選育本地的球蟲(chóng)株，本課題組應(yīng)用球蟲(chóng)單卵囊分離技術(shù)分離雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)莆田株，在此基礎(chǔ)上傳代選育其早熟系，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為福建省莆田市雞球蟲(chóng)病的免疫預(yù)防奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

1日齡愛(ài)拔益加（Arbor Acres，AA）肉雞，購(gòu)自莆田溫氏家禽有限公司，飼養(yǎng)于嚴(yán)格消毒的無(wú)球蟲(chóng)舍內(nèi)，自由采食和飲水。

1.2 試驗(yàn)飼料

由莆田市金日興生物科技開(kāi)發(fā)有限公司按本實(shí)驗(yàn)小雞營(yíng)養(yǎng)需要單獨(dú)配制，不添加任何抗生素和其他抗球蟲(chóng)藥物。

1.3 試驗(yàn)卵囊

1.3.1 卵囊收集

從福建省莆田市某雞場(chǎng)采集患有柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病的病死雞，刮取盲腸內(nèi)容物及黏膜，置于研缽內(nèi)研磨，加水?dāng)嚢?、過(guò)濾。將濾液以3 000 r/min離心沉淀10 min，棄上清液，沉淀物中加飽和鹽水，充分?jǐn)嚢杌靹蚝? 000 r/min離心漂浮10 min，取上層液，加入約10倍量水，充分混勻后3 000 r/min離心沉淀10 min，棄上清，沉淀中加入2.5%重鉻酸鉀溶液并移入平皿中，置26～27oC恒溫培養(yǎng)箱孢子化。孢子化期間，保持溶液深度不超過(guò)2 cm，每天用吸管反復(fù)吹打3～4次，至80%以上卵囊孢子化時(shí)為止。孢子化后的卵囊液置4oC冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 單卵囊分離

取冰箱中保存的孢子化卵囊懸液，2 000 r/min離心10 min，棄上清，以同樣的速度和時(shí)間離心3～4次，用生理鹽水洗去重鉻酸鉀，然后加飽和食鹽水漂浮，用牙簽沾取懸液，點(diǎn)在瓊脂塊上，在顯微鏡下觀察。確認(rèn)1個(gè)瓊脂塊只有1個(gè)卵囊，而且卵囊中有8個(gè)子孢子時(shí)，將含單個(gè)卵囊瓊脂塊經(jīng)口喂給4日齡無(wú)球蟲(chóng)雛雞。感染后5 d逐只查糞便，發(fā)現(xiàn)卵囊即為單卵囊后代，收集并孢子化。

用單卵囊繁殖的后代，接種無(wú)球蟲(chóng)雛雞進(jìn)行增殖，同時(shí)觀察在腸道寄生部位、病變特征。顯微鏡下觀察增殖后的卵囊形狀、顏色、大小等特征。用測(cè)微器隨機(jī)測(cè)量100個(gè)孢子化卵囊，孢子囊大小，計(jì)算卵囊形態(tài)指數(shù)。

1.3.3 蟲(chóng)株純化增殖

將單卵囊分離技術(shù)分離純化得到的卵囊，經(jīng)口感染小雞20只，收集增殖的卵囊，在2.5%的重鉻酸鉀溶液培養(yǎng)至孢子化后，置40C冰箱中保存。

1.4 早熟株選育

1.4.1 親代蟲(chóng)株確定

將分離、鑒定、增殖的純化卵囊確定為親代蟲(chóng)株，用于早熟系的選育、繁殖力和致病力的研究。

1.4.2 繁殖力測(cè)定

親代蟲(chóng)株卵囊每1個(gè)半月感染復(fù)壯1次。復(fù)壯后的親代卵囊與最近1代選出的早熟系（第6代）卵囊分別感染2周齡小雞10只，接種量為孢子化卵囊60個(gè)，感染96 h后，連續(xù)3 d分別收集、計(jì)數(shù)兩組小雞糞便排出的卵囊數(shù)量，計(jì)算方法按McMaster法[10]。

1.4.3 致病力檢測(cè)

試驗(yàn)設(shè)復(fù)壯后的親代卵囊組、最近一代選出的早熟系（第6代）卵囊組及不感染對(duì)照組，感染劑量為5×104個(gè)/只。感染當(dāng)天早晨試驗(yàn)用14日齡小雞逐只空腹稱(chēng)重，淘汰弱雛及體質(zhì)量過(guò)大者，編號(hào)。然后根據(jù)體質(zhì)量離散度隨機(jī)分組，每組30只。感染后1周結(jié)束試驗(yàn)，以各試驗(yàn)組的臨床表現(xiàn)、平均增重、相對(duì)增重率、死亡率和病變計(jì)分等為致病力指標(biāo)[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單卵囊分離結(jié)果

將用單卵囊分離獲得的20個(gè)單卵囊分別感染20只1日齡AA雞，其中7只感染成功，分別收集7只小雞糞便中的卵囊，并對(duì)他們的卵囊的形狀、大小進(jìn)行初步觀察和測(cè)量后，選擇了其中5號(hào)小雞所排的卵囊為親代蟲(chóng)株卵囊。

2.2 親代蟲(chóng)株卵囊大小的測(cè)量結(jié)果

將從5號(hào)小雞中分離出的親代蟲(chóng)株感染小雞，收集卵囊獲得一定數(shù)量的純化蟲(chóng)株卵囊后，測(cè)量增殖得到的卵囊及其孢子化卵囊大小各100個(gè)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 親代卵囊和孢子囊形態(tài)和大小

2.3 早熟系選育結(jié)果

本次選育實(shí)驗(yàn)共傳代6次，結(jié)果見(jiàn)表2。從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，經(jīng)過(guò)6代的早熟選育，第六代蟲(chóng)株的卵囊潛在期比親代的提前了6 h。

表2 早熟系繼代選育結(jié)果

2.4 繁殖力測(cè)定結(jié)果

分別用復(fù)壯后的親代蟲(chóng)株與初選出來(lái)的早熟系（即第6代）卵囊感染小雞，測(cè)定二者的繁殖力，結(jié)果見(jiàn)表3。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，經(jīng)過(guò)6代的早熟選育，早熟蟲(chóng)株的繁殖力已明顯下降，僅為親代的50.6 %。

表3 繁殖力測(cè)定

表4 致病性檢測(cè)結(jié)果

2.5 致病性檢測(cè)結(jié)果

用5×104個(gè)/只劑量作感染實(shí)驗(yàn)，早熟系和親代球蟲(chóng)致病結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出，經(jīng)6代早熟選育的莆田球蟲(chóng)株仍有一定的致病性，但與親代球蟲(chóng)相比，二者在死亡率、相對(duì)增重率、平均增重和病變計(jì)分等指標(biāo)方面均有較大差異，早熟系的致病性明顯減弱。

3 討論與結(jié)論

3.1 單卵囊分離技術(shù)

本研究應(yīng)用單卵囊分離技術(shù)從福建省莆田市球蟲(chóng)病雞糞便排出的卵囊中，成功的分離出了純種雞球蟲(chóng)蟲(chóng)株，根據(jù)對(duì)其卵囊形態(tài)（卵囊形態(tài)指數(shù)1.16）、大小（22.6×19.4）、寄生部位（盲腸）、親代潛在期（118 h）、卵囊孢子化時(shí)間（20 h）和病變特征的分析[11]，可以初步確定從福建省莆田市該雞場(chǎng)所分離的球蟲(chóng)株為柔嫩艾美耳球蟲(chóng)（Eimeria tenella）。

3.2 選育柔嫩艾美耳球蟲(chóng)早熟系

柔嫩艾美耳球蟲(chóng)莆田株經(jīng)6代的早熟選育，孢子化的卵囊有感染性，口服感染后在雞體內(nèi)繁殖，形成卵囊隨糞便排出體外，重復(fù)收集純化感染后最先排出的卵囊，獲得雞球蟲(chóng)早熟株。早熟蟲(chóng)株卵囊潛在期比親代蟲(chóng)株提前了6h，獲得了具有早熟傾向的蟲(chóng)株。

3.3 早熟系的繁殖力明顯下降

球蟲(chóng)的繁殖包括無(wú)性繁殖和有性繁殖階段由于早熟株最后一代裂殖生殖缺陷，導(dǎo)致了其繁殖力的下降。早熟柔嫩艾美耳球蟲(chóng)繁殖力只有親代的50.6%，明顯減弱。

3.4 早熟系的致病性顯著降低

綜合早熟柔嫩艾美耳球蟲(chóng)和親代蟲(chóng)株的臨床癥狀、死亡率、相對(duì)增重率、平均增重和病變計(jì)分的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，早熟柔嫩艾美耳球蟲(chóng)致病力減弱。這與國(guó)內(nèi)多個(gè)課題組研究結(jié)果一致[12-13]，由于早熟株最后一代裂殖生殖不完全，最后一代裂殖生殖快且內(nèi)含親本株較少的裂殖子，比親本提前進(jìn)入配子生殖，裂殖生殖世代的減少，對(duì)腸道上皮細(xì)胞的破壞力下降而使其毒性顯著降低。

早熟性狀是由基因決定的，甚為穩(wěn)定，一般不存在毒力回復(fù)突變的可能[14]。本研究選育的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)早熟系穩(wěn)定性好，繁殖力下降、致病性減弱，可以進(jìn)一步進(jìn)行免疫原性的研究，以便用于雞的免疫，預(yù)防雞的球蟲(chóng)病。

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