影響降解菌W2修復異草酮污染土壤的三種因子的優(yōu)化

劉亞光, 劉 蕊, 唐廣順

(東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院,哈爾濱 150030)

影響降解菌W2修復異草酮污染土壤的三種因子的優(yōu)化

劉亞光, 劉 蕊, 唐廣順

(東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院,哈爾濱 150030)

[目的]確定降解菌W2對土壤中異噁草酮的最優(yōu)生物修復條件。[方法]采用3因素5水平正交旋轉組合設計,室外盆栽生物測定方法,研究降解菌W2接種量、土壤含水量和肥料添加量3種田間可控因子對降解菌W2修復異噁草酮污染土壤效果的影響。[結果]確定修復條件的優(yōu)化數(shù)學回歸模型為:y=62.363 9+5.872 8×C1-4.494 1×C2C3-1.262 1×C21-4.076 7×C22,不同因子對土壤修復影響大小順序依次為土壤含水量、肥料添加量、降解菌W2接種量。[結論]降解菌W2對土壤中異噁草酮的最優(yōu)生物修復條件為:降解菌W2接種量 8.19～11.81 mL/kg(A650=0.4),土壤含水量18.6%～20.84%,肥料添加量1.83～2.52 g/kg。在此范圍內降解菌W2對異噁草酮有效成分濃度為500 μ g/kg的風干土壤30 d后的降解率可達60%以上,可接近該修復天數(shù)的理論極值65.56%。

異噁草酮; 降解菌W2; 降解率

異噁草酮是20世紀80年代FMC研制的有機雜環(huán)類選擇性苗前除草劑,抑制敏感植株葉綠素和類胡蘿卜素的合成,防除一年生禾本科雜草和闊葉雜草效果顯著[1-3],可廣泛應用于大豆、棉花、甘蔗、玉米、煙草等作物田[2,4]。異噁草酮在土壤中的生物活性長達16個月,在水中殘留為130 d以上,自然降解速度緩慢,其長殘留性不僅對后茬作物小麥、油菜、甜菜、向日葵以及多種蔬菜產(chǎn)生殘留藥害,亦影響到作物地周圍水生生物生長[5],嚴重地影響了種植業(yè)結構的調整和生態(tài)安全[6]。此類除草劑在土壤中不易發(fā)生光降解和水解,對土壤微生物和土壤酶活性有促進作用[7],其降解主要依靠微生物活動[8-9]。

2005年,本課題組從長期施用異噁草酮的黑土中分離出可高效降解該除草劑的降解菌W2,前期試驗得出在異噁草酮濃度500 μ g/kg風干土,田間持水量40%的條件下,接種20 mL/kg W2菌后降解半衰期為27.5 d,相比未接種土壤縮短63.9%[10]。該降解菌適應力強,在溫度20～37℃、pH6.0～9.0范圍內均生長良好[1]。國內外對異噁草酮的研究主要集中在除草機制、選擇性機制、代謝降解機理、安全性及與其他農(nóng)藥的配合作用等[3,5-6],異噁草酮微生物降解的研究以及對異噁草酮降解菌應用條件的摸索除了本課題組外還未見報道。影響生物修復效果的因素主要是被降解農(nóng)藥的種類和濃度、微生物群體的活性和環(huán)境因子[11]。而自然環(huán)境錯綜復雜,很多自然因素(溫度、土壤類型等)不可控,優(yōu)化可控因素能夠大幅度提高降解菌的降解效果[12-13]。土壤中的自然微生物無法迅速有效地降解土壤中污染物的情況下需要進行人工接種[14],作用效果顯著[15-16]。接菌量的多少勢必會影響該菌群在土壤中的生活力,劉亞光等[17]研究發(fā)現(xiàn)接種量對降解菌Y1降解土壤中異噁草酮有很大影響。并且,向土壤中添加肥料不僅可以為降解菌提高碳源和能源,也可以促進土壤呼吸[18],加快對異噁草酮的降解,前期試驗表明添加無機肥料效果好于有機肥料[12]。而土壤含水量和土壤呼吸呈線性相關[19],必然會影響W2菌的降解效果,且水分作為農(nóng)藥運輸擴散的溶劑對微生物的降解也有很大影響[20]。

本試驗擬對W2菌做進一步應用性研究。根據(jù)田間實際情況,利用生物測定方法,通過二次正交旋轉組合設計優(yōu)化降解菌接種量、土壤含水量和肥料添加量3種田間可控因素,確定降解菌W2的最優(yōu)生物修復條件,為異噁草酮降解菌劑應用于田間實際條件,最終解決異噁草酮的后茬危害問題,奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

降解菌W2(短桿菌屬Brevibacterium),為本課題組從東北農(nóng)業(yè)大學香坊農(nóng)場長期施用異噁草酮的試驗田中分離出的具有降解異噁草酮作用的需氧型細菌菌株,東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院農(nóng)藥與雜草教研室提供。培養(yǎng)基:牛肉膏 5 g,蛋白胨5 g,瓊脂 18 g,NaCl 5 g,蒸餾水1 L,pH7.0～7.2。

1.2 供試材料

供試藥品:異噁草酮(clomazone)480 g/L乳油,美國富美實公司。

供試作物:玉米,品種為‘東農(nóng)250’。

供試儀器:RXZ型智能人工氣候箱,寧波江南儀器廠;超凈工作臺,上海浦東躍欣科學儀器廠。

供試土壤:采自東北農(nóng)業(yè)大學香坊園藝站附近荒地(未施藥)。土壤為黑土,其理化性質如下:pH6.75,有機質含量 4.17%,全氮 0.185%,全磷0.546%,堿解氮 1.55 mg/kg,速效氮 0.955 mg/kg,速效鉀2.359 mg/kg。

供試肥料:通用性復合肥料,總養(yǎng)分含量 ≥45%,N 、P2O5、K2O 的比例為 12∶18∶15,黑龍江倍豐農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 建立異噁草酮含量生物測定標準曲線

異噁草酮通過抑制植株體內類胡蘿卜素和葉綠素的合成來抑制光合作用導致植株死亡[2]。本試驗采用玉米土培法[21]測定葉片葉綠素含量,建立土壤中異噁草酮濃度與葉綠素含量抑制率之間的標準曲線。第7天測葉綠素含量,建立標準曲線。異噁草酮有效成分濃度為 1～50 μ g/kg 時:y=-4.776 4x-0.676 2(R2=0.932 6);有效成分濃度 50 ～ 1 000 μ g/kg時:y=37.063x-172.75(R2=0.972 8)。

1.3.2 異噁草酮降解菌W2最佳修復條件的研究

3因素5水平正交旋轉組合設計見表1。

表1 試驗因素水平編碼表

降解菌W2濃度為A650=0.4。向風干土中添拌異噁草酮,按試驗設計,同時混拌降解菌、肥料和無菌水,使土壤中異噁草酮有效成分濃度為500 μ g/kg(等同田間有效施用量600 g/hm2)。土壤盆裝(上口徑8 cm×下口徑5.5 cm×高11 cm),上覆保鮮膜,置于溫室中,每2 d測量土壤濕度并及時補無菌水。培養(yǎng) 15、30、45、60、90 d后分別取土樣,參照玉米土培法[21],播種已催芽的玉米,每試驗重復4次,人工氣候箱中光暗交替(12 h∥12 h)培養(yǎng)。第7天測玉米葉綠素含量,根據(jù)標準曲線計算土壤中異噁草酮的含量。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

微生物對異噁草酮的降解率=(初始濃度-處理后殘留濃度)×100%/初始濃度。

應用DPS數(shù)據(jù)系統(tǒng)軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析,并用origin對旋轉回歸進行譜圖分析。

2 結果與分析

2.1 三元二次回歸方程的建立及檢驗

圖1所示,降解菌W2對異噁草酮的修復效果在0～90 d內隨著時間的延長修復的效果越好,90 d時降解率最高可達90.41%,且3個處理之間差異不顯著。處理8與處理1和0水平相比,降解率值雖略低,但降解均呈上升趨勢,且3個處理在30 d的時候,降解速度增幅最快,由13.59%、7.01%、27.15%升至 62.93%、41.37%、62.42%,差異顯著。本試驗選擇30 d作為修復時間,不僅具代表性且有利于試驗的展開。如表2,以30 d的降解率進行回歸分析,建立數(shù)學模型并對方程進行F檢驗、t檢驗,將回歸模型優(yōu)化為:

試驗中各因素貢獻率分別為 ΔC1=0,ΔC2=2.246 667,ΔC3=2.091 225,由此可知 3個因素對降解率影響大小順序依次為:土壤含水量、肥料添加量、降解菌接種量。

圖1 降解菌W2對異噁草酮的降解效果

表2 降解率試驗結果(30 d)

2.2 單因素降維分析

當其中2個因素水平分別都取-1,0,1時,分析第3個因素與異噁草酮降解率的關系。以試驗因素編碼號為橫坐標,以降解率為縱坐標,降維分析后得曲線如圖2所示。

圖2(a)可以看出,當其他2個因素固定時,W2菌接種量的提高,對降解效果沒有明顯的影響。充分說明降解菌W2在土壤中的適應能力好,生長繁殖速度快,對異噁草酮降解效果相差不大。圖2(b、c)可知,適度提高土壤含水量和外源肥料均可促進W2菌對異噁草酮的降解效果,但土壤含水量超過22.5%、肥料添加量超過2.5 g/kg,降解效果略有降低。

2.3 雙因素降維分析

根據(jù)數(shù)據(jù)繪制土壤含水量(%),肥料添加量(g/kg),接菌量(mL/kg)中雙因素交互作用時對降解率(%)影響的曲面圖。如圖3系列所示。

如圖3(a)所示,土壤含水量固定時,適度提高肥料添加量可顯著促進W2菌對異噁草酮的降解,且在土壤含水量為18.75%時達最高點。當肥料添加量固定于某一水平下時,W2菌對異噁草酮的降解效果隨著土壤含水量的增加呈先促進后抑制。圖3(b)所示,肥料添加量固定,接菌量的多少對異噁草酮的降解效果影響不明顯,同單因素試驗結果相同;接菌量固定,適度提高肥料用量,降解效果呈明顯上升趨勢。圖3(c)所示,當土壤含水量處于某一水平時,接菌量的增加,變化不明顯;接菌量固定時,適度土壤含水量提高,降解效果可明顯升高。因此,可少量施用降解菌W2,適當提高土壤含水量和肥料的用量,即可明顯促進對異噁草酮的降解。

2.4 模型的優(yōu)化分析

對模型進行優(yōu)化,求出理論極值。

ymax=65.56%,此時各因素的對應編碼值為(0,0,1),即C1(W2菌接種量)=10 mL/kg,C2(土壤含水量)=18.75%。C3(肥料添加量)=2.5 g/kg。

ymin=14.76%,此時各因素的對應編碼值為(-1.682,-1.682,-1.682),即C1(W2菌接種量)=1.6 mL/kg,C2(土壤含水量)=12.45%。C3(肥料添加量)=1.16 g/kg。

2.5 修復條件的優(yōu)化和驗證

利用頻數(shù)分析方法尋找最優(yōu)生物修復條件,其中大于60%的方案共有45個,頻數(shù)分析結果列于表3。

表3 降解率模型頻數(shù)分析

由表3可知,95%置信區(qū)間30 d后降解率超過60%的降解條件為接菌量8.19～11.81 mL/kg,土壤含水量18.6%～20.84%,肥料添加量1.83～2.52 g/kg。用45 d的數(shù)據(jù)對模型進行驗證,95%置信區(qū)間45 d后降解率超過71%的降解條件為接菌量8.95～11.09 mL/kg,土壤含水量17.9%～19.56%,肥料添加量1.89～2.11 g/kg,與 30 d回歸模型結果相符。

3 結論與討論

試驗通過優(yōu)化可控自然因素來保證并提高降解菌修復異噁草酮污染土壤的效果。得到了異噁草酮降解菌W2生物修復條件的優(yōu)化數(shù)學回歸模型y=62.363 9+5.872 8×C1-4.494 1×C2C3-1.262 1×C21-4.076 7×C22,此模型在試驗范圍內能較準確地預測降解菌W2對土壤中異噁草酮的降解率。在接種量1.6～18.4 mL/kg,土壤含水量12.45%～25.05%,肥料添加量1.16～2.84 g/kg范圍內,土壤含水量對降解率的影響作用最大,其次是外源肥料。土壤含水量在該范圍內可保證除草劑在土壤中的運輸及與降解菌的接觸幾率;但土壤含水量不能過高,否則將導致土壤含氧量降低,影響需氧菌W2的呼吸機制,進而影響降解效果。東北土壤含水量年均值22%[22],具冬季最高,夏季次之,春秋偏低的特點,可根據(jù)土壤含水量的大小綜合考慮確定施用降解菌的最適時期。外源肥料的添加不僅可以促進土壤呼吸[18],同樣可以促進土壤微生物的恢復,提高降解菌對污染物的降解活性,張超蘭在研究外源物質影響土壤微生物對甲磺隆和莠去津污染土壤的快速降解問題得到相同結論[13]。區(qū)別于其他學者得出的土壤中農(nóng)藥降解率與接菌量呈正相關的結論[15,23],本試驗中接菌量的增減與降解率之間的相關性不明顯,表明W2菌的群體適應力強,生長繁殖迅速,可有效降解殘留的異噁草酮,并且需要額外的碳源和能源來滿足生長,確保降解微生物的持續(xù)繁殖。所以,適度提高土壤含水量和肥料添加量即可顯著促進降解菌W2對異噁草酮的降解效果。

降解菌對土壤中異噁草酮的最優(yōu)生物修復條件:降解菌W2接種量 8.19～11.81 mL/kg(A650=0.4),土壤含水量 18.6%～20.84%,肥料添加量1.83～2.52 g/kg。在此范圍內降解菌W2對異噁草酮有效成分濃度為500 μ g/kg(等同田間有效施用量600 g/hm2)的風干土壤30 d后的降解率可達60%以上,可接近該修復天數(shù)的理論極值65.56%。修復90 d后的效果將更好。該菌適應能力強,在北方偏干的土壤中仍可有效降解異噁草酮。唐廣順[12]在異噁草酮有效成分濃度為700 μ g/kg,土壤含水量18.75%條件下接種10 mL/kg降解菌W2,90 d后玉米生長接近正常水平。

本研究最終目的是應用于生產(chǎn)實踐,而將降解菌制成微生物肥料不但有利于其在田間傳播,而且菌、肥同時施用也簡化了農(nóng)業(yè)操作,效果良好[24]。本試驗設置3個可控因素進行二次正交旋轉組合設計,優(yōu)化生物修復條件,確定最優(yōu)生物修復范圍,為下一步W2菌肥的研制和田間實際應用奠定了基礎,為最終解決異噁草酮的后茬危害問題,提供了相應的理論依據(jù)。

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Optimization of threefactors affecting clomazone degradation in contaminated soils by degrading bacteria W2

Liu Yaguang, Liu Rui, Tang Guangshun
(College of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin150030,China)

[Objective]To optimize the conditions for clomazone degradation in contaminated soils by degrading bacteria W2.[Method]Three factors affecting degradation rate were studied,including the soil moisture content,the amount of inoculation and fertilizer used.Based on the bioassay method,the degradation rates of bacteria W2under different conditions were compared by using orthogonally rotational combination design.[Result]Mathematical regression model for clomazone degradation was established as follows:y=62.363 9+5.872 8×C1-4.494 1×C2C3-1.262 1×C21-4.076 7×C22.The results demonstrated that the significance order affecting degradation rate was:the soil moisture content,the amount of fertilize used and the amount of inoculation.[Conclusion]When the amount of inoculation ranged from 8.19 mL/kg to 11.81 mL/kg,soil moisture content ranged from 18.6%to 20.84%,and the amount of fertilizer used ranged from 1.83 g/kg to 2.52 g/kg,the degradation rate was above 60%in air-dried soils containing 500 μ g/kg clomazone after 30 days,close to the highest degradation rate 65.56%.

clomazone; degrading bacteria W2; degradation rate

S 154;S 482.47

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2011.03.020

2010-04-13

2010-08-23

黑龍江省自然科學基金項目(C2007-20);大豆生物學省部共建教育部重點實驗室開放基金項目(SB08B03)

聯(lián)系方式 E-mail:liuyaguang@sina.com