含黃綠熒光蛋白基因的穿梭質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建*

于德水， 高 娃**， 沙長青， 張淑梅， 高繼國

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命學(xué)院,黑龍江哈爾濱150030;2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院,黑龍江哈爾濱150090;3.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所,黑龍江哈爾濱150010）

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)日益成熟并用于根圍生態(tài)學(xué)研究?，F(xiàn)有的報(bào)告基因主要有：β- 半乳糖苷酶（Lacz）、β- 葡糖苷酸酶（GUS）、分泌型胎盤磷酸酯酶（SEAP）、螢火蟲熒光素酶（LUC）等，但這些基因的檢測都需要底物和輔助因子，因而在活體中的應(yīng)用受到限制。綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是近年新興的一種報(bào)告分子，該蛋白能夠自身催化形成發(fā)色結(jié)構(gòu)并在紫外線或藍(lán)光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。作為報(bào)告基因，GFP是目前能在活細(xì)胞中表達(dá)的發(fā)光蛋白之一。作為熒光標(biāo)記分子，GFP具有熒光強(qiáng)度高、不需要底物（或輔助因子）、無種屬特異性、相對(duì)分子量小、易與其他蛋白融合、對(duì)細(xì)胞無傷害、易于檢測、可在活細(xì)胞實(shí)時(shí)觀察等特點(diǎn)，而優(yōu)于傳統(tǒng)的報(bào)告分子。GFP分子量相對(duì)較小，僅有27KD左右，它能與多種不同的蛋白質(zhì)N端或C端融合而保持其天然蛋白的特性，是一種直觀性很強(qiáng)的遺傳標(biāo)記物[1～3]。EYFP是GFP的突變體，是加強(qiáng)型GFP，具有檢測方便、熒光穩(wěn)定、易于構(gòu)建載體且對(duì)活細(xì)胞無毒害，對(duì)目的基因的功能也沒有影響，轉(zhuǎn)化后細(xì)胞可以繼續(xù)傳代等特點(diǎn)。目前成為重要的報(bào)告因子在動(dòng)物、植物和微生物學(xué)中廣泛應(yīng)用[4，5]。

本文采用基因重組技術(shù)將黃綠熒光蛋白基因重組到穿梭質(zhì)粒表達(dá)載體上，構(gòu)建了含黃綠熒光蛋白基因的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒表達(dá)載體，為生防枯草芽孢桿菌基因標(biāo)記以及菌株定殖的研究提供必備的實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究所用菌株與質(zhì)粒見表1。

表1 菌株與質(zhì)粒Table1 Strains and plasmid

1.1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

大腸桿菌用LB培養(yǎng)基（蛋白胨10g，氯化鈉10g，酵母抽提物 5g，水 1000mL，pH7.0，121℃滅菌20min。），37℃培養(yǎng)震蕩培養(yǎng)18h。

1.1.3 試劑

限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，DNA回收試劑盒，化學(xué)試劑：自大連寶生物工程公司。

1.1.4 抗生素與溶液

氨芐青霉素（Amp），工作濃度 50μg/mL；氯霉素（Cm），工作濃度 10μg/mL。

溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.HCl（pH8.0）,10mmol/LEDTA（pH8.0）；

溶液Ⅱ：0.2mmol/LNaOH，1%SDS；

溶液Ⅲ：5mmol/L乙酸鉀60mL，冰乙酸11.5mL，雙蒸水28.5mL；

TE：10mmol/L Tris.HCl （pH8.0），1mmol/L EDTA（pH8.0）；

RNase溶液：10mg RNase溶于1mL 10mmol/LTris.HCl（pH7.5），15mmol/L NaCl中，于100℃加熱15min，冷卻后保存于-20℃。

1.1.5 儀器

臺(tái)式高速離心機(jī)LG15-W，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；電熱恒溫水浴鍋HWS24，上海一恒科技有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱WMK-02，南京電器廠；紫外分光光度計(jì)LINDA，日本島津公司；電子分析天平AEL-160，日本島津公司；凝膠成像系統(tǒng)UVP，英國Cambridge紫外儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒提取

采用堿裂解法[6]從大腸桿菌中提取pEYFP和pHPS9質(zhì)粒DNA。

活化含pEYFP和pHPS9質(zhì)粒DNA的大腸桿菌，用-70℃保存的菌液劃線接種于LB加相應(yīng)抗生素固體平板上，37℃過夜培養(yǎng)；取單菌落轉(zhuǎn)接于5mL LB+Cm（pHPS9）和 5mL LB+Amp（pEYFP）液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)；按1%接種量再分別轉(zhuǎn)接于50mL LB加相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。次日取50mL菌液，在4℃，4000r/min轉(zhuǎn)數(shù)下，離心10min，棄去上清液，用2mL含10mg Lysozyme的溶液Ⅰ溶解菌體，室溫放置5min，加入4mL溶液Ⅱ，溫和倒置數(shù)次使其混合均勻，置于冰上10min，再加入3mL溶液Ⅲ，快速倒置數(shù)次于冰上10min，以13000r/min轉(zhuǎn)數(shù)離心30min，向上清液中加入0.6倍體積異丙醇，室溫放置15min，在12000r/min轉(zhuǎn)速數(shù)下離心30min，加入0.5mLTE溶解沉淀，再加入RNA酶10μL，放入37℃水浴中反應(yīng)1h，加入等體積酚、酚-氯仿、氯仿抽提，用100%乙醇沉淀質(zhì)粒DNA，用70%冰冷的乙醇洗1次，沉淀干燥后，溶于50μL TE中，置于-20℃冰柜中備用。

1.2.2 雙酶切反應(yīng)[7]

先用BamHI酶切 pEYFP和pHPS9質(zhì)粒DNA，10μL反應(yīng)體積中含1～2μg pEYFP或pHPS9質(zhì)粒DNA，1μL 10×Bbuffer，1～2UBamHI，加入 ddH2O 補(bǔ)足體積。將反應(yīng)管放于30℃水浴中2h后，置于70℃水浴10min，終止酶反應(yīng)。再用EcoRI酶切，在上述反應(yīng)液中加入 1～2U EcoRI，1μL 10×H buffer，加入ddH2O補(bǔ)足體積至20μL，將反應(yīng)管放于37℃水浴中2h后，置于70℃水浴10min，終止酶反應(yīng)。用酚-氯仿抽提酶切后的pHPS9質(zhì)粒DNA，乙醇沉淀，用ddH2O溶解沉淀。酶切后的pEYFP進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，回收約714bp的EYFPDNA片段。DNA片段回收采用試劑盒。

1.2.3 連接反應(yīng)

10 μL反應(yīng)體積中含有1μL 10倍連接緩沖液，2UT4DNA連接酶，適當(dāng)濃度比的EYFPDNA片段與pHPS9質(zhì)粒DNA，置于22℃水浴中連接4～6h，終止連接反應(yīng)。

1.2.4 感受態(tài)細(xì)胞制作與轉(zhuǎn)化

從平板上挑取E.coli.DH5α單菌落接種于5mLLB培養(yǎng)液中，37℃過夜培養(yǎng)，次日按1%接種量轉(zhuǎn)接于50mLLB培養(yǎng)液中，在37℃水浴搖床中快速震蕩培養(yǎng)至OD550=0.5。將培養(yǎng)液置于冰浴中10min之后，在4℃，5000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min，收集菌體，將菌體重新懸浮于25mL冰冷的50mmol/L CaCl2，10mmol/L Tris.HCl溶液中，冰浴中至少放置20min，在4℃，5000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min，將菌體再懸浮于2mL冰冷的50mmol/LCaCl2，10%甘油中，分成100μL體積一份，于4℃放置過夜后，立即放入-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

取100μL冷凍的感受態(tài)細(xì)胞放入冰浴中融化，加入 20μL 50mmol/LCaCl2，10mmol/L Tris.HCl溶液，再加入40～50ngDNA，混勻后，于冰浴中放置30min，立即放入42℃水浴中熱刺激2min，取出后加入100 μLLB培養(yǎng)液于37℃水浴中放置1h。取100μL培養(yǎng)液涂布于加有IPTG和X-Gal的LB平板上，然后將LB平板放置于37℃溫箱中過夜培養(yǎng)。

1.2.5 陽性重組子篩選與鑒定

隨機(jī)挑選單菌落，用煮沸法快提質(zhì)粒DNA，先用1%瓊脂糖凝膠電泳初篩DNA分子量大于質(zhì)粒載體（pHPS9）的重組子DNA，再用EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切方法進(jìn)一步驗(yàn)證重組子。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)粒DNA濃度與純度

用LB培養(yǎng)液過夜培養(yǎng)，取50mL菌液離心收集菌體，按方法所述提取質(zhì)粒DNA，用紫外吸收法測定DNA純度，瓊脂糖電泳法測定DNA分子量大小。50mL菌液可以獲得30μg pEYFPDNA和26μg pHPS9 DNA，經(jīng)測定，其 OD260∶OD280=1.76，瓊脂糖凝膠電泳表明DNA分子量與理論值相符。結(jié)果見圖2。

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

按照?qǐng)D1構(gòu)建表達(dá)載體。將EYFP基因連接到穿梭質(zhì)粒表達(dá)載體pHPS9多克隆位點(diǎn)區(qū)。

圖1 表達(dá)載體的構(gòu)建圖Fig.1 Construction figure of expressing carrier

2.3 陽性重組子篩選與鑒定

10 μL連接液轉(zhuǎn)化100μL感受態(tài)細(xì)胞，涂2個(gè)LB+Cm平板，37℃培養(yǎng)18h。每個(gè)平板上均有200多個(gè)轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)挑取10個(gè)轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒DNA，并用EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切下與EYFP基因大小一致的DNA片段，證明該轉(zhuǎn)化子為陽性重組子。結(jié)果見圖2、3、4。

圖2 質(zhì)粒pEYFP DNA電泳圖Fig.2 Electrophoresis map of plasmid pEYFPDNA EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切電泳圖

圖3 質(zhì)粒pHPS9-EYFP DNA電泳圖Fig.3 Electrophoresis map of plasmid pHPS9-EYFPDNA

圖4 陽性重組子雙酶切結(jié)果Fig.4 Result of dual enzyme cut of positive recombinator M：λDNA/HindⅢMarker

3 結(jié) 論

利用DNA重組技術(shù)，成功地將黃綠熒光蛋白基因（EYFP）重組到大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒表達(dá)載體pHPS9上，獲得了含EYFP基因的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒表達(dá)載體pHPS9-EYFP，從而為生防菌株的基因標(biāo)記提供了必要的材料。

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