李耀斌 聶 菁 呂 誠 胡小令 薛國勇 魯純糾 (南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，江西 南昌 330006)

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為阿爾茨海默病 (AD)與 β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積激活小膠質(zhì)細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)和神經(jīng)毒性作用有關(guān)。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌多種炎性介質(zhì)參與AD病理過程，其中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和前列腺素E2(PGE2)在這一過程起重要作用〔1～3〕。雷公藤內(nèi)酯醇是雷公藤中的主要有效成分之一，具有顯著的抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用，可通過抑制免疫細(xì)胞中炎性因子的表達(dá)而發(fā)揮其藥理作用〔4〕。故本實(shí)驗(yàn)擬用Aβ1-40誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的原代小膠質(zhì)細(xì)胞，建立AD細(xì)胞模型，并在此基礎(chǔ)上給予不同劑量中藥免疫抑制劑雷公藤內(nèi)酯醇進(jìn)行干預(yù)，觀察藥物對IL-1β和PGE2表達(dá)的影響，探討雷公藤對AD的可能作用機(jī)制，為臨床尋找防治AD的有效中藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生24 h SD大鼠，購自江西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 試劑 DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基、特優(yōu)級(jí)新生小牛血清、胰蛋白酶均為Invitrogen公司產(chǎn)品;胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品;鹽酸利多卡因 (10 ml注射液，有效含量0.2 g，分子量288.82);雷公藤內(nèi)酯醇、Aβ1-40均為Sigma公司產(chǎn)品;小鼠抗CD11b/c抗體 (CBL1512Z克隆號(hào)OX-42)為美國Chemicon International公司產(chǎn)品，人P物質(zhì)(SP)免疫組織化學(xué)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺 (DAB)顯色試劑盒和多聚L-賴氨酸為北京中杉公司產(chǎn)品;IL-1β、PGE2放射免疫試劑盒均為北京華英公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小膠質(zhì)細(xì)胞純化培養(yǎng) 按已有的小膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)方法〔5〕，采取24 h內(nèi)出生的SD乳鼠無菌條件下開顱取腦，仔細(xì)剝離血管和軟腦膜，磷酸鹽緩沖液 (PBS，0.01 mol/L)沖洗數(shù)次后剪碎，過200目細(xì)胞篩后離心棄上清，培養(yǎng)9 d左右，細(xì)胞充分分層生長后，加入鹽酸利多卡因溶液(12 mmol/L)，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 min，輕搖培養(yǎng)板2 min，鏡下觀察，待大量細(xì)胞懸浮后，收集細(xì)胞懸液，離心 (1 000 r/min 5 min)收集細(xì)胞，種植于6孔培養(yǎng)板，30 min后換液1次，去除未貼壁的細(xì)胞。加入含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。2～3 d換液1次，6 d后采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色對小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 取出培養(yǎng)中的蓋玻片，經(jīng)0.01 mol/L PBS洗滌細(xì)胞3次，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗滌細(xì)胞5 min 3次，3%H2O2去離子水孵育5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，滴加封閉用正常山羊血清工作液室溫孵育5 min，傾去，勿洗，滴加一抗CD11b/c(1∶100)，4℃ 過夜;PBS沖洗3 min 3次;滴加生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗工作液37℃ 10～15 min，PBS沖洗3 min×3次，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液 37℃ 10～15 min，PBS沖洗，3 min×3次，DAB顯色劑顯色，脫水，透明，封片，鏡下觀察攝片。以PBS(0.01 mol/L)緩沖液代替一抗做陰性對照。

1.2.3 Aβ1-40制備 將Aβ1-40溶于滅菌后的生理鹽水，37℃孵育7 d，使其變成凝聚態(tài)的Aβ1-40液備用。

1.2.4 細(xì)胞分組與藥物干預(yù) 小膠質(zhì)細(xì)胞按1×105/cm2細(xì)胞密度接種于24孔培養(yǎng)板 (預(yù)先放置多聚賴氨酸處理過的蓋玻片，每孔0.5 ml)分為4組 (每組8孔):5 μg/ml組加入終濃度為20 μg/ml的Aβ1-40和終濃度為5 μg/ml的雷公藤內(nèi)酯醇，25 μg/ml組加入終濃度為 20 μg/ml的 Aβ1-40和終濃度為25 μg/ml的雷公藤內(nèi)酯醇，模型組加入終濃度為20 μg/ml的Aβ1-40，對照組不處理。

1.2.5 IL-1β和 PGE2含量的檢測 各組細(xì)胞培養(yǎng)2、12、24 h后取上清于－20℃凍存;細(xì)胞培養(yǎng)上清液參照產(chǎn)品說明書用放射免疫法檢測IL-1β和PGE2的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)資料以±s表示，采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 Aβ1-40可誘導(dǎo)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β及PGE2表達(dá)上調(diào)20 μg/ml的Aβ1-40與大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞共孵育2、12、24 h后，分別提取細(xì)胞上清液，用放射免疫學(xué)的方法檢測IL-1β及PGE2的含量。Aβ1-40可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β表達(dá)明顯上調(diào)，而且在12 h達(dá)到高峰，上調(diào)率達(dá)44.9%，與對照組相比較有顯著性差異 (P＜0.01);在24 h后逐漸降低，上調(diào)率仍可達(dá)18.7%，與對照組比較仍有顯著性差異 (P＜0.05)。Aβ1-40在12 h可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞PGE2表達(dá)明顯上調(diào)，上調(diào)率達(dá)19%，與對照組相比較有顯著性差異 (P＜0.01)。見圖1。

圖1 不同Aβ1-40與大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞共孵育時(shí)間下Aβ1-40對小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β、PGE2表達(dá)的影響

2.2 雷公藤內(nèi)酯醇可抑制Aβ1-40誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β、PGE2表達(dá) 用 5、25 μg/ml的雷公藤內(nèi)酯醇、20 μg/ml的Aβ1-40與大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞共孵育2、12、24 h后，分別提取細(xì)胞上清液，用放射免疫學(xué)的方法檢測IL-1β、PGE2含量。當(dāng)加入雷公藤內(nèi)酯醇后可以抑制其 IL-1β的表達(dá)上調(diào)，尤其是在25 μg/ml、12 h 作用最強(qiáng)，IL-1β 表達(dá)下調(diào)了 36.6%，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01)。5 μg/ml的雷公藤內(nèi)酯醇在12 h可以抑制其PGE2的表達(dá)上調(diào)，PGE2表達(dá)下調(diào)了17.3%，與模型組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。

表1 不同濃度的雷公藤內(nèi)酯醇對細(xì)胞上清液中IL-1β、PGE2表達(dá)的影響(± s，n=8)

表1 不同濃度的雷公藤內(nèi)酯醇對細(xì)胞上清液中IL-1β、PGE2表達(dá)的影響(± s，n=8)

與對照組比較:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;與模型組比較:3)P ＜0.01，4)P ＜0.01;與5 μg/ml組比較:5)P ＜0.05，6)P ＜0.01

組別 IL-1β 2 h 12 h 24 h PGE2 2 h 12 h 24 h對照組 0.409 00±0.052 12 0.430 67±0.017 04 0.514 67±0.049 03 20.319±1.216 16.656±0.619 17.558±1.358模型組 0.538 67±0.024 832)0.624 00±0.007 002)0.611 00±0.076 181) 18.057±1.0361) 19.875±1.8112) 15.958±0.069 5 μg/ml組 0.599 00±0.010 152)0.485 67±0.062 853)0.273 00±0.041 152)3) 19.885±0.462 16.434±2.3944) 16.899±0.204 25 μg/ml組 0.554 00±0.057 302)0.395 33±0.091 743)5)0.447 00±0.010 03)6)17.331±1.8842)5) 19.594±1.5971)6) 18.176±0.1723)

3 討論

McGeer等〔6〕根據(jù)病理學(xué)、流行病學(xué)調(diào)查資料首先提出了AD的免疫炎癥學(xué)說，Aβ沉積激活小膠質(zhì)細(xì)胞是其核心病理機(jī)制。近年來，該學(xué)說在AD發(fā)病中的作用已經(jīng)被廣泛重視。一般認(rèn)為Aβ刺激小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β是炎癥反應(yīng)的始動(dòng)環(huán)節(jié)，IL-1β通過自分泌途徑促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和活化，啟動(dòng)IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-1等細(xì)胞因子的釋放，誘導(dǎo)補(bǔ)體、趨化因子和黏附分子的產(chǎn)生增加。這些免疫炎性因子反過來又激活小膠質(zhì)細(xì)胞，在體內(nèi)形成正反饋環(huán)路，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞變性壞死〔7〕。PG是花生四烯酸的代謝產(chǎn)物之一，普遍存在于體內(nèi)各組織中。PGE2作為其中一個(gè)主要的炎癥介導(dǎo)因子，不僅具有多種生理功能，而且在AD的炎性病理過程中也起到了重要的作用〔8〕，PGE2可刺激離體的重組人促紅素 (CHO細(xì)胞)Aβ的表達(dá)上調(diào)，其機(jī)制可能是通過激活PGE2受體進(jìn)而提高細(xì)胞水平上的 cAMP來實(shí)現(xiàn)的〔9，10〕。去除 PGE2受體，可以減少AD模型鼠中的氧化刺激炎性反應(yīng)以及老年斑中Aβ的沉積〔11〕。以上提示PGE2在AD的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用，但是其作用的具體機(jī)制尚存在爭議，這可能與PGE2的受體存在著四個(gè)亞型，而各亞型在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、組織定位和表達(dá)調(diào)控各有差異有關(guān)〔8〕。另外，流行病學(xué)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)在腦脊液中PGE2含量高的患者中僅有輕度的記憶障礙，但在低PGE2含量的患者中癥狀卻更為嚴(yán)重〔12〕。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平上證實(shí)了Aβ在12 h可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β和PGE2的表達(dá)到高峰，進(jìn)一步支持了AD的免疫炎癥學(xué)說。

雷公藤內(nèi)酯醇是從雷公藤中分離出的活性最高的環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化合物，有較強(qiáng)的抗炎及免疫抑制活性，在臨床上已得到廣泛應(yīng)用。本文前期工作表明，雷公藤內(nèi)酯醇可以抑制Aβ誘導(dǎo)的AD動(dòng)物模型海馬核因子-κB的活化和IL-1β的表達(dá)，改善其學(xué)習(xí)記憶能力〔13，14〕。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察雷公藤內(nèi)酯醇對Aβ誘導(dǎo)的AD細(xì)胞模型炎性介質(zhì)表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，加藥的兩組小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β和PGE2的表達(dá)在12 h較模型組明顯降低，表明雷公藤內(nèi)酯醇能抑制AD細(xì)胞模型IL-1β和PGE2的表達(dá)。因此認(rèn)為，雷公藤內(nèi)酯醇有可能通過抑制Aβ介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減少細(xì)胞因子等炎癥介質(zhì)的分泌，從而減輕炎性反應(yīng)，達(dá)到減輕神經(jīng)元損傷、改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的目的。但對于其確切的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

1 Krause DL，Müller N.Neuroinflammation，microglia and implications for anti-inflammatory treatment in Alzheimer's disease〔J〕.Int J Alzheimers Dis，2010;10:4061.

2 Heneka MT，O'Banion MK.Inflammatory processes in Alzheimer's disease〔J〕.J Neuroimmunol，2007;184(1-2):69-91.

3 Rogers J.The inflammatory response in Alzheimer's disease〔J〕.J Periodontol，2008;79(8):1535-43.

4 趙 湘，孫建實(shí)，金李君，等.雷公藤內(nèi)酯醇作用機(jī)制研究進(jìn)展〔J〕.中國中醫(yī)藥科技，2006;13(3):200-4.

5 趙 虎，朱長庚，魏 瑛，等.小膠質(zhì)細(xì)胞純化分離培養(yǎng)方法的改良〔J〕.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2007;16(1):115-21.

6 McGeer PL，Rogers J，McGeer EG.Neuroimmune mechanisms in Alzheimer disease pathogenesis〔J〕.Alzheimer Dis Assoc Disord，1994;8(3):149-58.

7 Lue LF，Kuo YM，Beach T，et al.Microglia activation and anti-inflammatory regulation in Alzheimer's disease〔J〕.Mol Neurobiol，2010;41(2-3):115-28.

8 Wei LL，Shen YD，Zhang YC，et al.Roles of the prostaglandin E2 receptors EP subtypes in Alzheimer's disease〔J〕.Neurosci Bull，2010;26(1):77-84.

9 Hoshino T，Nakaya T，Homan T，et al.Involvement of prostaglandin E2 in production of amyloid-beta peptides both in vitro and in vivo〔J〕.J Biol Chem，2007;282(45):32676-88.

10 Hoshino T，Namba T，Takehara M，et al.Prostaglandin E2 stimulates the production of amyloid-beta peptides through internalization of the EP4 receptor〔J〕.J Biol Chem，2009;284(27):18493-502.

11 Liang X，Wang Q，Hand T，et al.Deletion of the prostaglandin E2 EP2 receptor reduces oxidative damage and amyloid burden in a model of Alzheimer's disease〔J〕.J Neurosci，2005;25(44):10180-7.

12 Combrinck M，Williams J，De Berardinis MA，et al.Levels of CSF prostaglandin E2，cognitive decline，and survival in Alzheimer's disease〔J〕.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2006;77(1):85-8.

13 呂 誠，胡小令，萬 斌，等.雷公藤內(nèi)酯醇對阿爾茨海默病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬核因子-κB表達(dá)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2009;29(17):2186-8.

14 呂 誠，胡小令，楊寶林，等.雷公藤內(nèi)酯醇對阿爾茨海默病模型大鼠海馬白細(xì)胞介素-1β mRNA和蛋白表達(dá)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2010;30(9):1227-9.