蘇鉅年， 賴永長，皮 婷， 薛小燕， 林煉峰， 羅煥敏，，3*

(1．暨南大學(xué)藥學(xué)院神經(jīng)藥理研究室 廣東 廣州510632;2．暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系 廣東 廣州510632;3．暨南大學(xué)-香港大學(xué)腦功能與健康聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510632)

何首烏含有二苯乙烯苷類、蒽醌類化合物等，具有抗氧化、抗衰老、保肝、調(diào)節(jié)免疫和降血脂等方面的生物學(xué)活性［1］。當(dāng)前何首烏的研究大多都是集中在二苯乙烯苷類化合物的抗氧化和對神經(jīng)作用的特性上［2］，特別是何首烏的其他主要成分是否具有神經(jīng)方面作用尚未闡明，大黃素甲醚作為何首烏蒽醌類化合物的成分之一，對腦缺血具有保護(hù)作用，提示可對大黃素甲醚的神經(jīng)元營養(yǎng)作用作進(jìn)一步研究。本研究采用無血清體外培養(yǎng)原代皮質(zhì)神經(jīng)元來觀察大黃素甲醚對皮質(zhì)神經(jīng)元的存活及促突起生長的作用，以闡明其是否具有神經(jīng)營養(yǎng)作用。

1 材料

1．1 藥品與試劑 DMSO(北京鼎國);大黃素甲醚(中國藥品生物制品檢定所);DMEM/F12(美國Gibco);B27添加劑(美國Gibco);多聚賴氨酸(相對分子量7～15萬，美國Sigma);胰蛋白酶(美國Amersco);MTT(美國Sigma);胎牛血清(天津市灝洋生物制品科技);單克隆兔抗大鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE，武漢博士德);單克隆小鼠抗大鼠微管相關(guān)蛋白2(MAP2，美國Sigma);牛血清白蛋白(BSA)(博大泰克);即用型SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德);RT-PCR試劑盒(TaKaRa，批號:DRR019A);DNA Marker(TaKaRa);腺苷受體抑制劑 ZM241385(Tocris Bioscience，批號:13A/100775);酪氨酸激酶抑制劑 K252a(美國 Sigma，批號:BCBB3202)，其余試劑、藥品均為國產(chǎn)分析純。

1．2 動物 SPF級健康雌、雄SD大鼠，2～3月齡，體質(zhì)量約200g，廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號2007A003。

1．3 主要儀器 SW-CJ-1F型超凈臺(蘇州凈化設(shè)備)，IX71倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)，24孔板、96孔板(美國Corning)，培養(yǎng)箱(英國Galaxy S)，酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD)。

2 方法

2．1 分離及培養(yǎng)方法 參考 Brewer等的方法［3-5］，取12 h內(nèi)新生大鼠，75%酒精中浸泡消毒20s。超凈臺內(nèi)分離出大腦皮質(zhì)，剝離腦膜并去除海馬，D-hanks中浸洗，將其剪成約1 mm3大小，加入0．25%胰蛋白酶后35℃中消化，10min后用含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化。過濾、離心后取得神經(jīng)元，含0．4%B27的DMEM/F12培養(yǎng)基吹散細(xì)胞后用臺盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)目，制成所需細(xì)胞濃度的均勻細(xì)胞懸浮液，在預(yù)先用0．1 mg/mL的多聚賴氨酸處理的孔板中接種神經(jīng)元。接種后于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2．2 神經(jīng)元的鑒定 神經(jīng)元培養(yǎng)48 h，加入4%多聚甲醛固定，PBS漂洗后加入30%H2O2與純甲醇(1∶50)浸泡20 min，PBS漂洗后滴加山羊血清封閉液，孵育20 min，棄去上清液。加入1∶80的一抗PBS液，4℃濕盒內(nèi)放置12 h。PBS漂洗，用辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗，室溫放置20 min，PBS漂洗，加入 SABC，置于濕盒中20 min后用PBS漂洗，再用DAB顯色，PBS漂洗后鏡下觀察并拍照。

2．3 MTT比色法檢測細(xì)胞活性 0．4%B27的 DMEM/F12培養(yǎng)基制成濃度為8×106細(xì)胞/mL的神經(jīng)元細(xì)胞懸液，于預(yù)先多聚賴氨酸處理的96孔板中每孔100μL接種，4 h后換液同時加入終質(zhì)量濃度0．5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、4μmol/L大黃酸甲醚，并設(shè)定溶媒對照組和質(zhì)量濃度10 ng/mL bFGF的陽性對照組。置于培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)96 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入MTT(5 mg/mL DMEM/F12)100μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄清培養(yǎng)液，加入200μL二甲基亞砜(DMSO)，充分振蕩至晶體完全溶解，酶標(biāo)儀570 nm波長下讀取各孔吸光度值(A)［6］。每個組6個復(fù)孔，計(jì)算其平均值。

2．4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 大黃素甲醚溶解于DMSO，作用于神經(jīng)元，使終濃度為1、2、4μmol/L，另設(shè)立溶媒對照組和10 ng/mL bFGF陽性對照組。加藥72 h后，在顯微鏡(×400)下觀察各組神經(jīng)元生長情況，以胞體有光暈、長出突起的神經(jīng)元為記錄對象，每孔隨機(jī)選取12個視野，每組4個復(fù)孔。用Image-pro plus6．0圖像分析軟件處理照片，測量出每組神經(jīng)元平均突起長度［7-9］。

2．5 神經(jīng)元RNA樣品的制備 大黃素甲醚溶解于DMSO，作用于神經(jīng)元，使終濃度為1、2、4μmol/L，另設(shè)立溶媒對照組和終濃度10 ng/mL bFGF組。培養(yǎng)4 d后，棄去培養(yǎng)液，每組加1 mL TRIzol裂解，再加200μL三氯甲烷混勻，高速離心(10 000×g，15 min)，取其上清液，加等體積異丙醇混勻后離心沉淀(10 000×g，10 min)，加入75%乙醇洗滌沉淀，超凈臺內(nèi)晾干沉淀，加DEPC水溶解RNA。

2．6 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Genebank的序列，Primer5．0軟件設(shè)計(jì)大鼠GADPH和MAP-2的引物(見表1)，引物均委托英濰捷基(上海)貿(mào)易公司合成。

表1 大鼠MAP-2和GADPH的引物序列

2．7 測定 參照試劑盒說明書進(jìn)行神經(jīng)元MAP-2、GADPH mRNA量的測定、cDNA合成及PCR擴(kuò)增。

2．8 神經(jīng)營養(yǎng)作用機(jī)制的初步研究 按如下分組:K252a 100 nmol/L，ZM241385 20 nmol/L，大黃素甲醚 2 μmol/L，K252a 100 nmol/L+大黃素甲醚 2μmol/L，ZM241385 20 nmol/L+大黃素甲醚2μmol/L，溶媒對照組。分別作用于神經(jīng)元，加藥48 h 后按2．4 項(xiàng)方法處理［10-11］。

3 結(jié)果

3．1 體外培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察和鑒定 新生大鼠大腦皮層神經(jīng)元剛接種時胞體較小呈圓形，懸浮并均勻散布;接種4 h后開始貼壁，神經(jīng)元分布均勻，多數(shù)神經(jīng)元為圓形，少量細(xì)胞長出微小的突起。有少量的細(xì)胞碎片和紅細(xì)胞，更換培養(yǎng)基的方法除去未貼壁的神經(jīng)元、紅細(xì)胞和細(xì)胞碎片。培養(yǎng)24 h后有突起的細(xì)胞明顯增多，胞體變大，突起延長但仍較短小。培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞胞體明顯增大，多數(shù)呈梭形或圓梭形，每個細(xì)胞有2～4個突起，突起長度明顯增加，開始出現(xiàn)神經(jīng)網(wǎng)格。利用神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定法鑒定接種48h的細(xì)胞，結(jié)果顯示NSE陽性細(xì)胞占絕大多數(shù)，見圖1，表明絕大多數(shù)細(xì)胞(＞97%)是神經(jīng)元。

圖1 新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)觀察及鑒定

3．2 不同濃度藥物干預(yù)對神經(jīng)元存活的影響 MTT法檢測顯示，在該培養(yǎng)條件下，大黃素甲醚各劑量組均可顯著提高細(xì)胞活性，表明大黃素甲醚能促進(jìn)神經(jīng)元的存活(見表2)。

表2 大黃素甲醚對原代皮質(zhì)神經(jīng)元活性的影響 ( ± s，n=6)

表2 大黃素甲醚對原代皮質(zhì)神經(jīng)元活性的影響 ( ± s，n=6)

注:與溶媒組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01。

組別 藥物劑量 A值溶媒對照組0．1% 0．088 2 ±0．003 2 bFGF 組 10 ng/mL 0．153 2 ±0．012 3＊＊大黃素甲醚組 0．5 μmol/L 0．100 4 ±0．006 6＊＊1 μmol/L 0．115 8 ±0．008 0＊＊2 μmol/L 0．122 6 ±0．014 4＊＊4 μmol/L 0．124 2 ±0．011 3＊＊

3．3 形態(tài)學(xué)定量分析 加藥后72 h后，大黃素甲醚各劑量組突起長度明顯增長，與溶媒對照組相比，均有顯著性差異(P＜0．01)，各劑量組與 bFGF組之間無明顯差異(P＞0．18)。見表3，圖2(A ～E)。

表3 大黃素甲醚對培養(yǎng)72 h大鼠大腦皮層神經(jīng)元突起的影響( ± s，n=4)

表3 大黃素甲醚對培養(yǎng)72 h大鼠大腦皮層神經(jīng)元突起的影響( ± s，n=4)

注:與溶媒組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01。

組別 藥物劑量 平均突起長度/μm溶媒對照組0．1% 181．723 1 ±65．600 9 bFGF 組 10 ng/mL 318．551 9 ±72．689 6＊＊大黃素甲醚組 1 μL/mL 273．110 5±51．771 0＊＊2 μL/mL 289．727 8 ±51．791 7＊＊4 μL/mL 268．982 4 ±50．771 5＊＊

3．4 大黃素甲醚對大腦皮層神經(jīng)元MAP-2 mRNA表達(dá)的影響 從表4和圖3中可看出，0．5μmol/L、2μmol/L、4μmol/L大黃素甲醚組MAP-2 mRNA與內(nèi)參基因GADPH mRNA的含量百分比值較溶媒對照組顯著上升(P＜0．01)。

3．5 神經(jīng)營養(yǎng)作用機(jī)制的初步研究 從表5中看出，K252a 100 nmol/L組或K252a 100 nmol/L+大黃素甲醚2 μmol/L組與溶媒組比較，突起長度無明顯變化(P＞0．05);ZM241385 20nmol/L組與溶媒組比較能縮短突起長度(P＜0．01);大黃素甲醚2μmol/L組或ZM241385 20 nmol/L+大黃素甲醚2μmol/L組與溶媒組比較，能增加突起長度(P＜0．01)，且兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0．05)。

A．DMSO溶媒對照組 B．大黃素甲醚1μmol/L組 C．大黃素甲醚2μmol/L組D．大黃素甲醚4μmol/L組 E．bFGF 10ng/mL組 標(biāo)尺為50μmol/L

表4 大黃素甲醚對大鼠大腦皮層神經(jīng)元MAP2 mRNA量的影響 ( ± s，n=3)

表4 大黃素甲醚對大鼠大腦皮層神經(jīng)元MAP2 mRNA量的影響 ( ± s，n=3)

注:與溶媒組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01

組別 藥物劑量 MAP-2/GADPH(%)溶媒對照組0．1% 2．34 ±0．12 bFGF 組 10 ng/mL 36．12 ±3．04＊＊大黃素甲醚組 0．5 μmol/L 23．44 ±1．38＊＊2 μmol/L 28．12 ±1．95＊＊4 μmol/L 30．50 ±2．19＊＊

圖3 凝膠電泳圖片

表5 2種抑制劑對48 h大鼠大腦皮層神經(jīng)元突起的影響( ± s，n=3)

表5 2種抑制劑對48 h大鼠大腦皮層神經(jīng)元突起的影響( ± s，n=3)

注:與溶媒組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;與大黃素甲醚組比較，#P ＜0．05，##P ＜0．01

組別 藥物劑量 平均突起長度/μm溶媒對照組 0．2% 100．76 ±15．62##大黃素甲醚 2 μmol/L 158．46±36．81＊＊K252a+大黃素甲醚組100 nmol/L+2 μmol/L 104．27 ±15．91##K252a 100 nmol/L 105．25 ±20．78##ZM241385+大黃素甲醚組20 nmol/L+2 μmol/L 147．15 ±57．53＊＊ZM241385 20 nmol/L 74．10 ±23．85＊＊##

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為“腎生髓，腦為髓海”，“腎”與腦功能存在密切的聯(lián)系。通過補(bǔ)腎添髓可以防治衰老引起的記憶力下降。何首烏味苦、甘、澀，性溫。歸肝、腎經(jīng)?！堕_寶本草》中說其:“益氣血，黑髭鬢，悅顏色。久服長筋骨，益精髓延年不老”。具有補(bǔ)益精血、澀精止遺、補(bǔ)益肝腎的作用。自古何首烏就被當(dāng)成延年益智的藥物。大黃素甲醚為何首烏的主要成分之一，本實(shí)驗(yàn)觀察大黃素甲醚對體外培養(yǎng)的新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元突起生長及存活的影響。形態(tài)學(xué)定量分析，細(xì)胞活性測定和MAP-2mRNA表達(dá)量的測定結(jié)果顯示，與溶媒對照組相比，1～4μmol/L組均可以提高細(xì)胞活力、促進(jìn)神經(jīng)元突起的生長(P＜0．01);bFGF與1～4μmol/L加藥組相比，對神經(jīng)元突起長度的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．3);MAP2 mRNA電泳顯示，各加藥組和bFGF組與溶媒對照組相比，能明顯增加MAP-2 mRNA表達(dá)的量(P＜0．01)，表明大黃素甲醚具有神經(jīng)營養(yǎng)作用。在形態(tài)學(xué)分析中，可能是由于4μmol/L組存活的細(xì)胞較多，每個細(xì)胞生長的空間較少，抑制突觸的生長，以致4μmol/L組比2μmol/L組的平均突起長度略短。

神經(jīng)營養(yǎng)作用機(jī)制的初步研究中發(fā)現(xiàn)，加入腺苷受體抑制劑不能阻斷大黃素甲醚促進(jìn)對神經(jīng)元突起生長的作用(與大黃素甲醚2μmol/L相比P＞0．05);而加入酪氨酸激酶抑制劑能阻斷大黃素甲醚促進(jìn)對神經(jīng)元突起生長的作用(與大黃素甲醚2μmol/L相比 P＜0．01)。提示大黃素甲醚可能是通過直接或間接激活Trk受體起營養(yǎng)作用，而非通過腺苷受體起營養(yǎng)作用。

神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病、帕金森綜合癥、亨廷頓病等，都與神經(jīng)突起和神經(jīng)元的丟失相關(guān)，主要因?yàn)樯窠?jīng)元缺乏營養(yǎng)或受到有害物質(zhì)損傷引起。

內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子家族如NGF、BDNF等，在神經(jīng)元生長、存活、分化，調(diào)節(jié)突觸可塑性方面具有重要［12-13］。但外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子缺點(diǎn)也比較突出，如分子量大、不易透過血腦屏障、易引起疼痛等，致使它們在臨床應(yīng)用過程中受到很多限制。近年研究表明，有神經(jīng)營養(yǎng)因子類似作用的小分子物質(zhì)有預(yù)防突觸丟失、突起損傷的作用，具有治療神經(jīng)退行性變的潛力。神經(jīng)營養(yǎng)作用的小分子物質(zhì)可以克服神經(jīng)營養(yǎng)因子的上述缺點(diǎn)，用于治療神經(jīng)退行性疾病的潛力。大黃素甲醚為小分子中藥單體，脂溶性好，具有一定的神經(jīng)營養(yǎng)作用，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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