李健英，王連芝

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040)

淫羊藿為小檗科淫羊藿屬植物，是使用最為悠久及藥用來源種類最多的中藥之一，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［1］。淫羊藿性辛、甘、溫，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的作用。目前研究證明，淫羊藿含有多種化學(xué)成分，有豐富的藥理作用。現(xiàn)代研究認(rèn)為，淫羊藿苷是主要成分，作為藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)的指標(biāo)［2］，具有激素樣作用。淫羊藿在老年性骨質(zhì)疏松癥的臨床防治中，其療效已得到肯定，對(duì)破骨細(xì)胞有直接抑制作用［3］，能直接作用于人成骨細(xì)胞，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和功能，影響骨的代謝［4］。

壯骨靈膠囊(由淫羊藿、白術(shù)、熟地黃等五味中藥組成)有補(bǔ)腎壯骨、健脾行氣、活血止痛功效，用于治療骨質(zhì)疏松癥。本研究采用高效液相色譜法，對(duì)壯骨靈膠囊中淫羊藿苷含量進(jìn)行測(cè)定，控制藥品質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)表明，該方法操作簡便、穩(wěn)定、精密度高、結(jié)果準(zhǔn)確重現(xiàn)性好，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

高效液相色譜儀(美國Waters公司:Waters2695－2998型);超純水處理器(Millipore公司);KQ一250B超聲波清洗器;電子分析天平(瑞士 METTLER－TOLEPO公司);淫羊藿苷對(duì)照品(中國藥品生物研究所提供，批號(hào)110737－200414);壯骨靈膠囊(黑龍江中醫(yī)大學(xué)中醫(yī)藥研究院制備，批號(hào)201026);色譜純乙腈(天津康巢科技開發(fā)有限公司，批號(hào)20090609);水為超純水，甲醇、乙酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱 Diamonsil C18柱(5μm，250mm ×4.6mm);流動(dòng)相:乙睛 － 水(30∶70);檢測(cè)波長:270nm;柱溫:40℃;流速:1.0mL/min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 待測(cè)樣品溶液 壯骨靈膠囊內(nèi)容物粉末0.5g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加低濃度乙醇20mL，稱定重量，超聲處理30min，再稱定重量，用低劑量乙醇補(bǔ)足減量，搖勻、過濾、取續(xù)濾液，即待測(cè)樣品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液 精密稱取淫羊藿苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含10μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 取除淫羊藿外的其他味藥材，按壯骨靈膠囊制備方法制備陰性制劑，取陰性制劑0.5g按(2.2.1)制備方法得陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 精密吸取淫羊藿苷溶液15μl，注入高效液相色譜儀，理論板數(shù)淫羊藿苷峰不低于2 500。淫羊藿苷對(duì)照品保留時(shí)間為=10.715min，色譜峰峰面積積分值為582 588，確定此色譜峰為淫羊藿苷對(duì)照品的色譜峰，色譜圖見圖1。

圖1 淫羊藿苷對(duì)照品的色譜圖

2.4 線性關(guān)系試驗(yàn) 按色譜條件分別取對(duì)照品溶液，用0.45μm 的微孔濾膜過濾，精密吸取 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μl對(duì)照品溶液，注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖。以進(jìn)樣含量為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。各濃度相應(yīng)的峰面積經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理，求得回歸方程為Y=3 903 265X－2 442.1，相關(guān)系數(shù) r=0.999 9，結(jié)果表明，淫羊藿苷在 0.1～0.18μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1。

圖2 線性關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5 空白干擾實(shí)驗(yàn) 精密吸取供試品(壯骨靈膠囊)溶液、陰性對(duì)照溶液，對(duì)照品溶液，在2.1色譜條件進(jìn)樣，壯骨靈膠囊色譜圖在10.261min處出現(xiàn)色譜峰，見圖3，陰性溶液色譜圖見圖4，由圖可知陰性溶液、壯骨靈溶液含量測(cè)定無干擾。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果

圖3 壯骨靈膠囊中淫羊藿苷色譜圖

圖4 空白溶液色譜圖

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取濃度為10μg/mL的淫羊藿苷對(duì)照品溶液15μL，連續(xù)5次注入同一臺(tái)液相色譜儀中，考察精密度，以峰面積計(jì)算 RSD，淫羊藿苷RSD=0.4%。說明精密度良好，測(cè)定結(jié)果可靠。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取供試品，按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于 0、2、4、6、8、10h 分別進(jìn)樣按設(shè)定時(shí)間測(cè)定，計(jì)算淫羊藿苷含量，平均含量0.284 3(mg/g)，RSD=1.7%，表明樣品在制備后 10小時(shí)內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.8 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品5份，按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定。計(jì)算淫羊藿苷含量，平均含量0.292 5(mg/g)，RSD=1.6%，表明該方法重現(xiàn)性好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品6份，各約0.2g，精密稱定，分別加入濃度為10μg/mL的淫羊藿苷對(duì)照品溶液10mL，即0.1mg，混勻后，按2.2.1項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣，測(cè)定，計(jì)算淫羊藿苷含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法回收率較高，測(cè)定結(jié)果可靠，平均回收率102.48%，RSD=1.35%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

2.10 樣品含量測(cè)定 取三批供試品(批號(hào)20101026、201028、20101108)，每批2 份，每份約0.5g，精密稱定，按2.2.1項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣20μL，測(cè)定峰面積。取 10μg/mL的淫羊藿苷對(duì)照品溶液進(jìn)樣15μL，峰面積積分值為586 896.5，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量，結(jié)果表明，3批供試品中，淫羊藿苷含量平均值為0.287 8mg/g，按降幅10%為本品含量限定值，則其含量應(yīng)不低于0.26mg/g，按此規(guī)定上述測(cè)得3批供試品溶液均合格，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定

3 討論

參照《中國藥典》和文獻(xiàn)資料，選擇淫羊藿苷檢測(cè)波長為 270nm，流動(dòng)相:乙睛 －水(30∶70)，柱溫:40℃，流速:1.0mL/min，此方法樣品處理簡單操作方便，重現(xiàn)性好，精度高，可用于壯骨靈膠囊質(zhì)量控制。

超聲技術(shù)在中藥有效成分提取、分離與制備工藝中的應(yīng)用，大大提高了提取率，縮短了提取時(shí)間。

采用不同提取溶劑實(shí)驗(yàn)，如甲醇、70%乙醇、50%乙醇等，結(jié)果以低濃度乙醇超聲提取 2次，每次30min，方法簡單，雜質(zhì)干擾少，提取比較完全。

［1］ 蔡德，佘白蓉，楊綺華，等.淫羊藿總黃酮提取及其含量測(cè)定［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，21(1):75 －76.

［2］ 謝娟平，孫文基.淫羊藿屬植物化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2006，18(5):17 －19.

［3］ 傅得興，高素強(qiáng)，張紅梅.淫羊藿及其復(fù)方防治骨質(zhì)疏松的研究進(jìn)展［J］.中國中藥雜志，1999，24(4):249 －251.

［4］ 于波，楊久山，劉巖，等.淫羊藿苷對(duì)人成骨細(xì)胞的作用［J］.中醫(yī)正骨，2006，18(6):17 －18.