白云，孫強，包順茹，章艷

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

缺血性腦血管疾病又稱腦缺血，是一種嚴重危害老年人健康和生存質量的常見病，具有發(fā)病率高、致殘率高、預后差、易復發(fā)等特點，居腦血管病死亡原因之首，因而對缺血性腦血管疾病的研究就顯得十分迫切［1］。腦缺血在中醫(yī)學中屬“中風”范疇。中風的中醫(yī)藥治療歷史悠久，中藥由于多成分、多層次和毒副作用小、協(xié)同作用強的特點，在腦缺血的預防、治療與康復方面呈現(xiàn)顯著優(yōu)勢［2－3］。本課題組以“瘀血生風”假說為基礎，提出活血熄風方。此方經(jīng)臨床實踐驗證，對中風患者具有確切療效。本課題組在前期已經(jīng)證實活血熄風方對腦缺血具有神經(jīng)保護作用的基礎上［4－5］，通過檢測對模型大鼠腦組織 NF － κBp65蛋白的表達情況，以期進一步明確活血熄風方抗腦缺血的作用機制，為研發(fā)出作用機制明確而安全有效的抗腦缺血中藥新藥奠定實驗基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

Wistar大鼠，體質量為270～350g，雄性，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。在室溫18℃ ～25℃、相對濕度40%～60%的環(huán)境中適應性飼養(yǎng)1周。大鼠手術前12h開始禁食，自由飲水。

1.2 藥品、試劑

活血熄風方(由當歸、紅花、川芎等組成，黑龍江中醫(yī)藥大學藥理教研室制備);銀杏葉片(批號101108，唐山榮大藥業(yè)有限公司);尼莫地平片(批號101201，西安博愛制藥有限公司);PV6001二步法檢測試劑盒(北京中杉生物技術有限公司);NF－κBp65抗體(美國SANTA Cruz公司)。

1.3 實驗儀器

Q500IW圖像分析儀(德國Leica);生物組織包埋機(湖北孝感)。

2 實驗方法

2.1 動物分組

將Wistar大鼠隨機分成活血熄風方高劑量組、中劑量組、低劑量組，銀杏葉片組，尼莫地平組，模型對照組和假手術組。除假手術組10只外，其余每組16只。

2.2 給藥方法

活血熄風方高、中、低劑量組分別灌胃給予活血熄風方10g/kg、5g/kg、2.5mg/kg;銀杏葉片組灌胃給予銀杏葉片135mg/kg;尼莫地平組灌胃給予尼莫地平片21.6mg/kg;模型對照組及假手術組灌胃給予等量生理鹽水。各組大鼠均連續(xù)灌胃給藥7天。

2.3 右側大腦中動脈阻塞(MCAO)模型制作

于末次給藥30min后，進行右側MCAO阻塞模型手術。參照Longa［6］方法，并稍加改良，10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。將大鼠仰臥位固定后，行頸正中線切口，分離左側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，在頸總動脈遠心端和近心端及頸外動脈處分別掛線備用。用蛙心夾夾閉頸內動脈，近心端結扎頸總動脈和頸外動脈，距頸總動脈分叉部4～5mm處剪一小口，隨后打開蛙心夾，用眼科鑷子輕推拴線(直徑0.23～0.25mm、長3cm的魚線)，直至插入到頸內動脈中大約18mm左右，稍微感到阻力后停止進線，系牢頸總動脈遠心端的細線，將傷口縫合，單籠飼養(yǎng)。

2.4 神經(jīng)功能評分

MCAO手術后，于大鼠意識恢復30min時，對各組大鼠進行神經(jīng)功能缺陷評分。計分在1～3分者納入研究，每組選擇8只進行以下實驗。

2.5 大鼠腦組織NF－κBp65蛋白含量測定

上述評分合格大鼠，以10%水合氯醛(劑量為350mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，立即開胸暴露心臟，將右心耳剪掉，經(jīng)左心室插管至升主動脈，將大約150ml肝素化生理鹽水于5min內全部灌注于左心室中。隨后灌注含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸緩沖溶液200ml。灌注完畢后，從大鼠枕骨大孔剪開，完整取出大鼠腦組織，于4℃相同固定液中固定，制作病理組織切片。隨后參照試劑盒說明書，以PV－6001二步法進行操作。

2.6 結果判定

采用光學顯微鏡觀察大鼠腦組織皮質區(qū)，以細胞核出現(xiàn)鮮艷的棕黃色染色顆粒的細胞為陽性細胞，每張切片高倍鏡下隨機選擇不重合的5個視野，采用圖像信號采集與分析系統(tǒng)拍照并計數(shù)每個視野中陽性細胞數(shù)，計算平均值。

2.7 統(tǒng)計學處理

以SPSS11.5 for Windows統(tǒng)計軟件分析處理實驗結果，采用方差分析，所得數(shù)據(jù)用(±s)表示。

3 實驗結果

實驗結果顯示，模型對照組與假手術組相比，模型大鼠腦皮質NF－κBp65蛋白表達有明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。同時活血熄風方高劑量組、中劑量組、低劑量組及尼莫地平組、銀杏葉片組分別與模型對照組相比，模型大鼠腦皮質NF－κBp65蛋白表達亦有增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(結果見表1、圖1)。

圖1 活血熄風方對MCAO模型大鼠腦皮質

表1 活血熄風方對MCAO模型大鼠腦皮質NF－κBp65蛋白表達的影響(±s)

表1 活血熄風方對MCAO模型大鼠腦皮質NF－κBp65蛋白表達的影響(±s)

注:與模型對照組相比，*P＜0.05;模型對照組與假手術組相比，▲P ＜0.05。

組別 n 劑量(mg/kg)陽性細胞數(shù)假手術組 8 等體積28.49 ±12.81模型對照組 8 等體積 42.08±6.56▲活血熄風方高劑量組 8 10 35.18 ±4.70*活血熄風方中劑量組 8 5 33.11 ±6.22*活血熄風方低劑量組 8 2.5 34.70 ±7.46*銀杏葉片組 8 135 34.37 ±7.12*尼莫地平組 8 21.6 35.04 ±3.72*

4 討論

腦缺血是多環(huán)節(jié)、多因素、多途徑損傷的酶促級聯(lián)反應，其病理生理機制非常復雜，因此從中藥中尋找多靶點、多途徑、多效應的腦缺血治療藥物是一條有效途徑。本研究以“瘀血生風”假說為理論基礎，提出活血熄風方。此方由當歸、紅花、川芎等多味中藥組成，具有活血化瘀、熄風止痙之功效。經(jīng)多年臨床實踐證實，對腦缺血患者具有較好療效。為進一步探討活血熄風方抗腦缺血的作用機制，本研究通過觀察活血熄風方對MCAO模型大鼠腦皮質NF－κBp65蛋白表達的變化，旨在為研發(fā)出作用機制明確、安全有效的防治腦缺血的中藥新藥提供實驗依據(jù)。

NF－κB存在于神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質細胞和腦血管內皮細胞中，是一種氧化應激反應性轉錄因子。當機體發(fā)生缺血性腦損傷時，機體產(chǎn)生將一系列內源性因子參與到活化NF－κB的過程中。活化后的NF－κB可以促使即早基因、粘附分子、細胞因子和細胞表面受體等的表達。當發(fā)生急性腦缺血時，在粘附分子的介導下，白細胞在血管內皮細胞中滾動、粘附并且外漏，從而引發(fā)炎癥級聯(lián)反應［7－10］。因此，NF － κB 被認為是血管內皮細胞受損的始動機制之一。本研究中通過觀察活血熄風方對MCAO模型大鼠腦皮質NF－κBp65蛋白表達的變化，發(fā)現(xiàn)活血熄風方能抑制MCAO模型大鼠腦皮質NF－κBp65的表達。由此，我們推測活血熄風方對MCAO模型大鼠腦皮質神經(jīng)保護的作用機制可能與其抑制NF－κBp65蛋白的表達有關。然而NF－κBp65是否參與了活血熄風方對MCAO模型大鼠的神經(jīng)保護作用，亦或只是其伴隨現(xiàn)象，尚需今后通過實驗進一步證實。

［1］ 丁波.缺血性腦卒中中醫(yī)治療的現(xiàn)代研究進展［J］.中國民康醫(yī)學，2010，22(15):1995 －1996.

［2］ 喻斌，沈祥春，方泰惠，等.腦缺血的分子生物學研究及中藥的保護作用［J］.中藥新藥與臨床藥理，2004，15(3):219 －221.

［3］ 鈔建峰，賈慧，孫風平.試述以“虛”為核心的中風病機觀［J］.中醫(yī)藥學報，2011，39(2):67 －68.

［4］ 白云，章艷，孫強.活血熄風方對MCAO局灶性腦缺血模型大鼠腦組織Caspase－3蛋白表達的影響［J］.中醫(yī)藥信息，2011，28(2):63－65.

［5］ 白云，顏培宇，梁穎.活血熄風方對MCAO局灶性腦缺血模型大鼠腦皮質ICAM－1蛋白表達的影響［J］.中醫(yī)藥學報，2011，39(1):13－15.

［6］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Revesible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats［J］.Stroke，1989，20:84 －91.

［7］ Altavilla D，Saitta A，Squadrito G，et al.Evidence for a role nuclear factor－ kappaB in acute hypovolem ic hem orrhagic shock［J］.Surgery，2002，131:50 －58.

［8］ BhakarAL，Tannis LL，Zeindler C，et al.Constitutivenuclear factor－kappa B activity is required for central neuron survival［J］.J Neurosci，2002，22:8466 －8475.

［9］ 包翠芳，閔連秋，田步先，等.前列地爾對局灶性腦缺血大鼠腦組織核因子κB的影響［J］.中國腦血管病雜志，2007，4(6):268－272.

［10］ Williams AJ，Hale SL，Moffett JR，et al.Delayed treatment with MLN519 reduces infarction and associated neurologic deficitcaused by focal ischemic brain injury in rats via antiinflammatory mechanisms involving nuclear factor－ κappaB activation，gliosis，and leukocyteinfiltration［J］.JCareb Blood FlowMetab，2003，23:75 －87.