浙南海域腹瀉性貝毒分析

張樹剛, 鄒 清, 陳 雷, 郜鈞璋

（國家海洋局 溫州海洋環(huán)境監(jiān)測中心站, 浙江 溫州 325027）

浙南海域腹瀉性貝毒分析

張樹剛, 鄒 清, 陳 雷, 郜鈞璋

（國家海洋局 溫州海洋環(huán)境監(jiān)測中心站, 浙江 溫州 325027）

在浙南海域共采集了 10種貝類 40份樣品。運用高效液相色譜方法檢測腹瀉性貝毒, 共檢出 9份樣品含有腹瀉性貝毒。染毒樣品檢出的腹瀉性貝毒（軟海綿酸, OA）質(zhì)量比為0.07～5.85 μg/g, 共有7個樣品含量超標(biāo), 超標(biāo)率為17.5%。無論是檢出率還是超標(biāo)率, 都呈現(xiàn)夏季＞春季＞秋季的規(guī)律。浙南海域的南部腹瀉性貝毒檢出率和超標(biāo)率比北部和中部都高。紫貽貝、縊蟶、泥蚶和青蛤較其他種類易富集腹瀉性貝毒。養(yǎng)殖的貝類檢出率及超標(biāo)率均高于野生的貝類。

浙南海域; 高效液相色譜; 腹瀉性貝毒

有毒赤潮作為一種海洋災(zāi)害, 對養(yǎng)殖業(yè)、海洋生態(tài)系統(tǒng)和人類健康的危害越來越大, 引起人們越來越多的關(guān)注。作為海洋藻毒素之一的腹瀉性貝毒廣泛存在于世界各地, 由其引起的中毒事件時有報道。腹瀉性貝毒是一種脂溶性物質(zhì), 其化學(xué)結(jié)構(gòu)是聚醚或大環(huán)內(nèi)酯化合物。在中國引發(fā)腹瀉性貝毒的藻類有: 漸尖鰭藻（Dinophy sisacuminata）、具尾鰭藻（D.cuta）、倒卵形鰭藻（D. fortii）、利馬原甲藻（Prorocentrum lima）等。在貝類和其他動物的濾食或攝食過程中, 海水中產(chǎn)生腹瀉性貝毒的藻類作為食物轉(zhuǎn)移到它們的胃或食道中, 經(jīng)胃和腸消化、吸收并導(dǎo)致 DSP在貝體內(nèi)的積累[1]。浙南海域海洋資源豐富, 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá), 是浙江省重要的水產(chǎn)品生產(chǎn)基地。但近年來該海域有毒赤潮爆發(fā)頻繁[2-7], 給當(dāng)?shù)氐乃a(chǎn)養(yǎng)殖以及海洋環(huán)境帶來很大影響, 但有關(guān)該海域的腹瀉性貝毒研究資料卻很少。本研究選擇浙南海域幾個比較典型的海域, 采集經(jīng)濟型貝類樣品, 用高效液相色譜法檢測腹瀉性貝毒, 了解腹瀉性貝毒在浙南海域的變化規(guī)律, 為管理及有關(guān)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù), 也為相關(guān)部門制定適宜的腹瀉性貝毒監(jiān)測方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和預(yù)處理

于2009年5月至2009年12月, 在浙南海域的玉環(huán)、溫嶺、樂清、洞頭、龍灣、靈昆島、瑞安、平陽、蒼南、南麂島等地采集養(yǎng)殖或野生的主要經(jīng)濟貝類, 共采集了厚殼貽貝、紫貽貝、太平洋牡蠣、縊蟶、泥蚶、文蛤、青蛤、疣荔枝螺、藤壺、牡蠣等 10種貝類 40份樣品（采樣點如圖1）。貝類樣品用現(xiàn)場海水沖洗干凈后放入聚乙烯袋中, 壓出袋內(nèi)空氣, 封緊袋口, 冷凍保存轉(zhuǎn)移至實驗室。毒素在貝類消化腺中含量最高, 但本研究考慮到人們在日常食用貝類時很少特意去除消化腺后才食用, 因此直接取全部軟組織作為毒素分析部分, 具有現(xiàn)實經(jīng)濟意義。

1.2 腹瀉性貝毒的制備

貝類樣品在實驗室內(nèi)室溫自然解凍, 打開貝殼,取貝體全部軟組織作為測定對象。用紗布過濾掉多余的水分, 取一定量的軟組織用分散勻質(zhì)機勻漿。稱取 2 g勻漿組織加 4 mL 80%的甲醇水溶液, 振蕩5 min, 懸浮液以3000 r/min, 離心10 min, 取3 mL上清液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中, 加入3 mL水和8 mL醋酸異丙酯, 振蕩 1 min, 分層后, 將醋酸異丙酯相轉(zhuǎn)到蒸發(fā)小瓶中, 水相再加8 mL醋酸異丙酯提取, 合并醋酸異丙酯相, 蒸干, 并用3 mL 20%的正己烷丙酮溶液溶解, 準(zhǔn)備凈化。

分別用10 mL丙酮, 10 mL甲醇和10 mL 20%的正己烷丙酮溶液沖洗C18- SPE小柱, 完成活化。然后將上述提取液加到柱子上凈化, 先后用1 mL 20%的正己烷丙酮溶液和 10 mL 3%的甲醇丙酮溶液沖洗。棄去沖洗液, 用10 mL 40%的甲醇丙酮溶液洗脫,DSP組分隨著10 mL 40%的甲醇丙酮溶液洗脫液流出。

取100 μL上述樣品洗脫液, 轉(zhuǎn)到棕色反應(yīng)瓶中,N2吹干, 加 100 μL 0.1% 4-溴甲基 7-甲氧基香豆素（溶解在丙酮里）和100 μL 0.3% N, N-二異丙基乙胺（也溶在丙酮里）, 暗處 50℃反應(yīng) 2 h, 反應(yīng)后即可用于HPLC測定。

1.3 高效液相色譜條件

流動相: 乙晴/甲醇/水（58 : 5 : 37）; 流速: 1.2 mL/min; 柱溫30℃; 熒光檢測器的激發(fā)波長325 nm,發(fā)射波長390 nm。毒素分析所用高效液相色譜系統(tǒng)為HP1200系列（Agilent公司, 美國）; C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm, 5μm）; 軟海綿酸（OA）標(biāo)準(zhǔn)毒素購自加拿大海洋生物研究所（NRC）。

2 結(jié)果

2.1 腹瀉性貝毒檢測結(jié)果

此次檢測的40份樣品中, 共檢出9份樣品含有腹瀉性貝毒, 檢出率為 22.5%, 檢測結(jié)果見表 1。染毒樣品檢出的腹瀉性貝毒（OA）為0.07～5.85 μg/g, 我國目前暫定的腹瀉性貝毒警戒標(biāo)準(zhǔn)是針對小白鼠生物檢測法[8], 即0.05 Mu/g, 相當(dāng)于0.2 μg/g, 參照此標(biāo)準(zhǔn), 共有7個樣品含量超標(biāo), 超標(biāo)率為17.5%。其中 2009年 8月采于南麂島的養(yǎng)殖紫貽貝貝毒（OA）高達(dá)5.85 μg/g。本方法的檢出限為0.02 μg/g。

2.2 不同季節(jié)腹瀉性貝毒分析結(jié)果

本實驗采集的貝類包括三個季節(jié)的樣品: 春季、夏季及秋季。其中春季樣品9個, 有2個樣品檢測出含有腹瀉性貝毒, 檢出率為 22.2%, 超標(biāo) 1個, 超標(biāo)率11.1%; 夏季樣品25個, 有6個樣品檢測出含有腹瀉性貝毒且均超標(biāo), 檢出率和超標(biāo)率都為 24%; 秋季樣品6個, 有1個樣品檢測出含有腹瀉性貝毒, 檢出率為16.7%, 未超標(biāo)。

2.3 不同海區(qū)腹瀉性貝毒分析結(jié)果

浙南海域海岸線長, 海域遼闊, 從北往南可分為 3個重點海域: 北部樂清灣海域（樂清、溫嶺、玉環(huán)等）、中部甌江口海域（龍灣、靈昆島、洞頭島等）、南部南麂列島海域（瑞安、平陽、蒼南等）。樂清灣海域共采集15個樣品, 有3個樣品檢測出含有腹瀉性貝毒, 檢出率為 20%, 超標(biāo) 2個, 超標(biāo)率 13.3%; 甌江口海域共采集13個樣品, 有2個樣品檢測出含有腹瀉性貝毒且均超標(biāo), 檢出率和超標(biāo)率都為 15.4%;南麂列島海域共采集12個樣品, 有4個樣品檢測出含有腹瀉性貝毒, 檢出率為 33.3%, 超標(biāo) 3個, 超標(biāo)率25%。

2.4 腹瀉性貝毒敏感種及生態(tài)習(xí)性染毒比較

在檢測的10種貝類中, 只在紫貽貝、縊蟶、泥蚶和青蛤中檢測到腹瀉性貝毒, 而其他幾種貝類均未檢出毒, 這說明紫貽貝、縊蟶、泥蚶和青蛤是腹瀉性貝毒敏感種, 較其他種類易富集腹瀉性貝毒。

此次檢測的40個樣品中, 生態(tài)習(xí)性為野生的樣品有 9個, 其中含腹瀉性貝毒的有 1個, 檢出率為11.1%, 未超標(biāo); 生態(tài)習(xí)性為養(yǎng)殖的樣品有31個, 其中含腹瀉性貝毒的樣品有8個, 檢出率為25.8%, 超標(biāo)7個, 超標(biāo)率為22.6%。

3 討論

3.1 腹瀉性貝毒季節(jié)性分布特征

本實驗分析結(jié)果表明, 浙南海域腹瀉性貝毒的檢出率較高, 已檢出的樣品毒性也較高, 9個檢出樣品中有7個超標(biāo)。各季節(jié)都有檢出腹瀉性貝毒, 就整體檢出率而言, 夏季＞春季＞秋季, 而超標(biāo)率也呈現(xiàn)夏季＞春季＞秋季的特征。

軟海綿酸是腹瀉性貝毒的主要成分, 腹瀉性貝毒檢測方法也是以它為主要對象進(jìn)行研究。本實驗也是以 OA含量來表示腹瀉性貝毒含量。考慮到可能存在其他成分的腹瀉性貝毒如 DTX1, 實際腹瀉性貝毒含量可能會更高。

表1 浙南海域經(jīng)濟貝類腹瀉性貝毒檢測結(jié)果Tab. 1 DSP in shellfishes collected from the coastal waters of south Zhejiang

腹瀉性貝毒主要來源于鰭藻, 浙南海域分布著具尾鰭藻[9], 這就為貝類富集腹瀉性貝毒提供了條件。雖然在該海域具尾鰭藻不是優(yōu)勢種, 但因該海域營養(yǎng)鹽充足, 具尾鰭藻相對于中肋骨條藻等優(yōu)勢浮游生物沒有較高的細(xì)胞豐度, 但其長期以一定數(shù)量存在時, 客觀上為貝類攝食提供了更為豐富的選擇,腹瀉性貝毒經(jīng)食物鏈傳遞在貝體內(nèi)吸收、富集的可能性也大為提高。另外浙南海域在不同季節(jié)受江浙沿岸流、臺灣暖流和浙南上升流影響, 不僅群落種類組成更迭頻繁, 群落中各生物種群之間的數(shù)量關(guān)系也經(jīng)常變化, 為群落中少數(shù)具有高度生態(tài)適應(yīng)能力的種類提供繁殖生長的機會。這也可能造成具尾鰭藻在適宜的條件下間斷性地成為優(yōu)勢種, 貝類攝食后累積腹瀉性貝毒的幾率增大, 這些都可能是浙南海域各季節(jié)都有腹瀉性貝毒分布的重要原因。而春、夏季腹瀉性貝毒檢出率和超標(biāo)率高于秋季的原因可能與春夏季赤潮爆發(fā)頻繁有關(guān)。根據(jù)以往的資料顯示[2-7],浙南海域的赤潮主要發(fā)生在4～7月, 也即春、夏季, 此時毒素轉(zhuǎn)移、積累在貝體內(nèi)的幾率相應(yīng)也增大。

3.2 腹瀉性貝毒地域分布特征

本次調(diào)查結(jié)果表明, 不同海域的腹瀉性貝毒分布是有差異的, 南麂列島海域腹瀉性貝毒檢出率和超標(biāo)率比樂清灣海域和甌江口海域都高。反應(yīng)出該海區(qū)腹瀉性貝毒分布最廣, 含量最高。

出現(xiàn)這種地域性分布特征可能與有毒藻的分布及豐度有關(guān)。南麂列島海域有毒藻的豐度較其他海域為高。南麂列島海域是浙江沿岸流與臺灣暖流交匯和交替消長的區(qū)域, 流系復(fù)雜, 鋒面發(fā)達(dá), 水色終年較清, 這些獨特而多樣的生態(tài)環(huán)境為浮游植物的生長和繁衍提供了十分理想的條件。另外影響藻類地理分布的一個重要原因是溫度。各種藻類都有其生長和繁殖的水溫范圍, 海水溫度常決定著藻類的地理分布。相對于樂清灣海域和甌江口海域, 南麂列島海域的水溫更適宜藻類的大量繁殖。

不可否認(rèn), 貝類染毒是多種因素綜合作用的結(jié)果, 除了與毒素來源生物, 生境的群落結(jié)構(gòu), 水環(huán)境理化參數(shù)等外因有關(guān)外, 還與貝類對藻類的攝食率、濾水率, 對毒素的吸收代謝能力, 貝類的個體生理差異等內(nèi)因有關(guān)。腹瀉性貝毒地域分布差異的確切原因仍需深入的研究。

3.3 腹瀉性貝毒累積的種間特征

此次檢測的10種40份貝類中, 檢測出腹瀉性貝毒的分別是1份野生紫貽貝, 1份養(yǎng)殖青蛤, 2份養(yǎng)殖紫貽貝, 2份養(yǎng)殖泥蚶, 3份養(yǎng)殖縊蟶。后面三類覆蓋了所有的超標(biāo)樣品。

可以看出, 養(yǎng)殖的貝類無論檢出率還是超標(biāo)率均高于野生的貝類。養(yǎng)殖區(qū)多為淺海水域, 水體交換速度慢, 水體自凈能力較弱。筏式養(yǎng)殖的高度發(fā)達(dá), 養(yǎng)殖排、架密度過大, 使水流更不暢, 分布更為集中[10]。這就造成一方面大量生物代謝物無法及時為底棲生物消耗和海水微生物分解, 另一方面投放的餌料難以完全消化, 導(dǎo)致沉積。長期密集養(yǎng)殖使這些海區(qū)積累大量的氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì), 致使局部地區(qū)出現(xiàn)富營養(yǎng)化, 在這樣的情況下, 一旦受季風(fēng)流、氣候等影響,出現(xiàn)合適的水溫、鹽度條件, 便會引起浮游生物的大量繁殖, 引發(fā)赤潮[11], 上述原因造成養(yǎng)殖區(qū)貝類腹瀉性貝毒檢出率高于野生貝類的特征。

紫貽貝對腹瀉性貝毒有良好的吸收富集能力,對毒素的累積較其他貝類更為優(yōu)先[12], 因此在紫貽貝中的檢出率和含量較高。腹瀉性貝毒來源不僅僅限于營養(yǎng)型游動藻細(xì)胞, 單細(xì)胞藻經(jīng)常以孢囊的形式存在于海底沉積物中, 這些有毒孢囊如果被生長在海底或灘涂上的貝類攝食, 毒素相應(yīng)地會轉(zhuǎn)移到貝體中, 這可能也是泥蚶、縊蟶和青蛤中貝毒檢出率高的原因。

[1] 楊維東, 彭喜春, 劉潔生, 等. 腹瀉性貝毒研究現(xiàn)狀[J]. 海洋科學(xué), 2005, 29（5）: 66-72.

[2] 溫州市海洋與漁業(yè)局．2003年溫州市海洋環(huán)境質(zhì)量公報[R]. 溫州: 溫州市海洋與漁業(yè)局, 2004.

[3] 溫州市海洋與漁業(yè)局．2004年溫州市海洋環(huán)境質(zhì)量公報[R]. 溫州: 溫州市海洋與漁業(yè)局, 2005.

[4] 溫州市海洋與漁業(yè)局．2005年溫州市海洋環(huán)境質(zhì)量公報[R]. 溫州: 溫州市海洋與漁業(yè)局, 2006.

[5] 溫州市海洋與漁業(yè)局．2006年溫州市海洋環(huán)境質(zhì)量公報[R]. 溫州: 溫州市海洋與漁業(yè)局, 2007.

[6] 溫州市海洋與漁業(yè)局．2007年溫州市海洋環(huán)境質(zhì)量公報[R]. 溫州: 溫州市海洋與漁業(yè)局, 2008.

[7] 溫州市海洋與漁業(yè)局．2008年溫州市海洋環(huán)境質(zhì)量公報[R]. 溫州: 溫州市海洋與漁業(yè)局, 2009.

[8] 中國標(biāo)準(zhǔn)化工作委員會. SN 0294-93 出口貝類腹瀉性貝類毒素檢驗方法[S]. 北京: 北京標(biāo)準(zhǔn)出版社,1993.

[9] 陳舜, 李揚, 李歡, 等. 南麂列島海域浮游植物的群落結(jié)構(gòu)研究[J]. 海洋環(huán)境科學(xué), 2009, 28（2）: 170-175.

[10] 尤仲杰, 徐善良, 謝起浪. 浙江沿岸的貝類資源及其增養(yǎng)殖[J]. 東海海洋, 2000, 18（1）: 50-56.

[11] 吳施衛(wèi), 張純超, 盧楚謙, 等. 南海近岸海域腹瀉性貝類毒素分析[J]. 海洋環(huán)境科學(xué), 2005, 24（4）: 48-51.

[12] 戴紅, 李奶姜, 陳國斌. 福建三都灣赤潮監(jiān)控區(qū)的麻痹性貝毒和腹瀉性貝毒研究[J]. 海洋環(huán)境科學(xué), 2005,24（1）: 44-47.

Received: Jan., 15, 2010

Key words:coastal waters of south Zhejiang; high performance liquid chromatography; diarrhetic shellfish poisoning

Abstract:Forty samples belonging to 10 species of shellfishes were collected in coastal waters of south Zhejiang.Diarrhetic shellfish poisoning （DSP） toxins were detected in 9 samples with high performance liquid chromatography （HPLC）. The contents of DSP were between 0.07 to 5.87 μg/g; 7 samples （17.5%） exceeded the safety threshold.The positive rate and over-standard rate of DSP were mainly presented in Summer and the south.Mytilus edulis,Sinnovacula constricta,Tegillarca granosaandCyclina sinensisshowed high contents of DSP toxins. Moreover cultured shellfishes had stronger ability to accumulate DSP than wild shellfishes.

（本文編輯:梁德海）

Analysis of diarrhetic shellfish poisoning toxins in shellfishes collected from the coastal waters of south Zhejiang

ZHANG Shu-gang, ZOU Qing, CHEN Lei, GAO Jun-zhang

（Wenzhou Marine Environmental Monitoring Center Station, SOA, Wenzhou 325027, China）

X835

A

1000-3096（2011）01-0044-04

2010-01-15;

2010-05-26

浙江省海洋環(huán)保和生態(tài)資金資助項目（浙海漁計[2008]140號）

張樹剛（1979-）, 男, 安徽淮南人, 工程師, 主要從事海洋環(huán)境與有毒赤潮研究, 電話: 0577-88854079, E-mail: shugangzhang@sina.com