南麂島海洋沉積物抑菌真菌的篩選及其代謝產(chǎn)物特性的初步研究

李書(shū)平, 劉輝輝, 呂鳳麟, 李勁松, 劉佳明, 趙淑江

（1. 溫州醫(yī)學(xué)院 環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院, 浙江 溫州 325035; 2. 溫州醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 溫州 325035）

南麂島海洋沉積物抑菌真菌的篩選及其代謝產(chǎn)物特性的初步研究

李書(shū)平1, 劉輝輝1, 呂鳳麟1, 李勁松2, 劉佳明1, 趙淑江1

（1. 溫州醫(yī)學(xué)院 環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院, 浙江 溫州 325035; 2. 溫州醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 溫州 325035）

以7種水產(chǎn)病原菌為指示菌, 采用菌餅法對(duì)分離自南麂島海域的15個(gè)沉積物樣品中的78株海洋真菌進(jìn)行抑菌活性初篩, 獲得了對(duì)至少一種病原指示菌有抑菌活性的菌株19株。采用打孔擴(kuò)散法對(duì)這19株真菌的發(fā)酵液進(jìn)行抑菌活性復(fù)篩, 共有9個(gè)菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)一種或者幾種病原指示菌有抑制作用, 其中菌株NJ0104的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)除燦爛弧菌（Vibrio splendidus）之外的6種指示菌均有抑制作用, 尤以對(duì)副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）的抑制活性為最強(qiáng)。對(duì)菌株NJ0104次級(jí)代謝產(chǎn)物中抑菌活性物質(zhì)的初步研究表明, 抑菌活性物質(zhì)在80 ℃以下、紫外照射40 min時(shí)穩(wěn)定性良好, pH穩(wěn)定范圍在4.0～7.0之間, 能較好地溶解于正丁醇中。結(jié)果表明: 南麂島海域的沉積物中分布著豐富的真菌資源, 分離得到的海洋真菌NJ0104具有較高的研究?jī)r(jià)值, 值得深入研究其活性成分及抑菌機(jī)理。

南麂島; 海洋沉積物; 海洋真菌; 抑菌活性; 理化性質(zhì)

海洋真菌因其能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、功能多樣的生物活性物質(zhì)而備受關(guān)注, 不少研究者都對(duì)海洋真菌及其活性代謝產(chǎn)物做了大量的研究[1～3], 但這些研究多集中在共生真菌方面, 對(duì)海底沉積物來(lái)源的真菌研究較少。海底沉積物中含有大量的有機(jī)質(zhì), 為海洋真菌提供了良好的生境, 沉積物真菌多吸附在海泥微粒上生長(zhǎng)[4]。近幾年, 已有研究者對(duì)海洋沉積物真菌的分離及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究, 結(jié)果發(fā)現(xiàn),海洋沉積物來(lái)源的真菌能夠產(chǎn)生多種生物活性代謝產(chǎn)物, 如溶血活性、抗菌、抗腫瘤、以及抗氧化性化合物等[5-9]。

南麂島位于我國(guó)浙江沿岸海域, 距離大陸30多海里, 海域底質(zhì)以粉砂質(zhì)黏土為主, 該海域?yàn)榕_(tái)灣暖流和沿岸流相互交匯和交替消長(zhǎng)的區(qū)域, 成為海洋生物生長(zhǎng)棲息的良好場(chǎng)所, 具有豐富的海洋生物多樣性, 被譽(yù)為“貝藻王國(guó)”, 南麂島海洋自然保護(hù)區(qū)是我國(guó)建立的第一個(gè)海島海域生態(tài)系自然保護(hù)區(qū)。近年來(lái), 雖然不同海域沉積物真菌的報(bào)道日益增多, 但對(duì)南麂島海域海洋真菌資源的研究卻鮮有報(bào)道。另外, 目前對(duì)海洋真菌抑菌活性的研究多集中于人類致病菌上, 而在防治水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌方面的報(bào)道甚少?；【鷮偌?xì)菌的致病特點(diǎn)為傳播快、傳染率高, 已成為海水魚(yú)類養(yǎng)殖最大的危害, 對(duì)海洋生物弧菌病的防治已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注。黃耀堅(jiān)等[10]從廈門(mén)海區(qū)潮間帶分離到287株真菌, 其中有20株能夠抑制鰻弧菌的生長(zhǎng)。馬欣悅等[11]從大連海區(qū)的海藻中獲得了 21株對(duì)費(fèi)氏弧菌有拮抗作用的附生真菌。盡管并未進(jìn)行深入的研究, 但這些成果足以證明海洋真菌在防治水產(chǎn)病原菌方面有著巨大潛力。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)采自南麂島海域的15個(gè)沉積物樣品中的真菌進(jìn)行了較為系統(tǒng)的分離, 從中篩選出對(duì) 7種水產(chǎn)病原指示菌有抑制作用的海洋真菌, 并初步研究了活性菌株代謝產(chǎn)物中抑菌活性物質(zhì)的理化性質(zhì),旨在發(fā)掘有潛在應(yīng)用價(jià)值的活性菌株, 為南麂島藥用海洋真菌資源的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采集自南麂島海域5個(gè)采樣站位（圖 1）, 共15個(gè)沉積物樣品。圖中M1站位在養(yǎng)殖區(qū), M2、M3、M4、M5站位位于遠(yuǎn)離養(yǎng)殖區(qū)的海域。

樣品采集后, 立即裝入無(wú)菌塑料袋內(nèi), 置于放有冰塊的保溫箱內(nèi)暫存, 次日送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。

圖1 南麂島海域采樣站位Fig. 1 Sampling stations in the Nanji islands

1.2 病原指示菌

副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）、溶藻弧菌（V. alginolycis）、哈維氏弧菌（V.harveyi）、創(chuàng)傷弧菌（V.vulnificus）、鰻弧菌（V.anguillarum）、燦爛弧菌（V.splendidus）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）。

1.3 培養(yǎng)基及試劑

1.3.1 真菌分離培養(yǎng)基

察氏培養(yǎng)基（CA）成分: 葡萄糖30 g, 硝酸鈉2 g,磷酸氫二鉀1 g, 氯化鉀0.5 g, 硫酸鎂0.5 g, 硫酸亞鐵0.01 g, 瓊脂18 g, 陳海水 1 000 mL, pH 7.2±0.2。

沙氏培養(yǎng)基（SDAY）成分: 蛋白胨 10 g, 葡萄糖40 g, 瓊脂 18 g, 陳海水 1000 mL, pH 7.2±0.2。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）成分: 馬鈴薯200 g, 葡萄糖 20 g, 瓊脂 18 g, 陳海水 1 000 mL,pH 7.2±0.2。

上述真菌分離培養(yǎng)基均采用與樣品同一采集地點(diǎn)的海水和底泥浸出液配制, 兩者的體積比為 9:1。配制好的培養(yǎng)基, 121℃高壓滅菌30 min, 待冷卻至50～60℃時(shí), 加入抗生物青霉素和鏈霉素, 終質(zhì)量濃度均為30 mg/L。

底泥浸出液的制作方法為: 稱取與樣品同一采集地點(diǎn)的底泥1 000 g, 加入海水1 000 mL, 煮沸30 min, 暗處放置2 d, 取上清液, 海水定容至1 000 mL備用。

1.3.2 真菌發(fā)酵培養(yǎng)基

改良 CA液體培養(yǎng)基（A）成分: 葡萄糖 15 g, 淀粉15 g, 蛋白胨5 g, 硝酸鈉2 g, 磷酸二氫鈉1 g, 氯化鉀0.5 g, 硫酸鎂0.5g, 硫酸亞鐵0.01 g, 硫酸銨1 g,陳海水1 000 mL, pH 7.2±0.2。

改良 PDA 液體培養(yǎng)基（B）成分: 馬鈴薯 200 g,葡萄糖15g, 陳海水1000 mL, pH 7.2±0.2。

1.3.3 指示菌培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基成分: 蛋白胨10 g, 牛肉膏3 g,氯化鈉 5 g, 瓊脂 18 g, 陳海水 1 000 mL, pH 為7.2±0.2。不加瓊脂即為營(yíng)養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基。

1.3.4 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）

0.2 mol/L NaH2PO4: 31.2 g NaH2PO4·2H2O 溶于1 000 mL蒸餾水中, 為A液; 0.2 mol/L Na2HPO4:71.7 g Na2HPO4·12H2O溶于1000 mL蒸餾水中, 為B液; A液和B液的體積比為39 : 61。

1.4 菌株分離

將采回的沉積物樣品放在無(wú)菌操作臺(tái)上, 用滅菌刀片刮去與外界接觸的表面部分, 將1.0 g沉積物樣品放入盛有 10 mL無(wú)菌海水的三角燒瓶?jī)?nèi), 加入分散劑聚山梨酯?80（濃度 1/20 000）[12], 于漩渦混合振蕩器上振蕩 3～5 min, 使其充分混勻, 靜置, 取上清液作為原液, 然后用無(wú)菌海水依次稀釋成 10?1、10?2、10?3三個(gè)濃度梯度。

采用常規(guī)的平板涂布法。用移液槍分別吸取10?2、10?3稀釋度的 100 μL 樣品液到相應(yīng)的真菌分離培養(yǎng)基平板上, 用無(wú)菌涂布器在平板上涂布均勻,于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d。待菌絲長(zhǎng)出后, 挑取形態(tài)各異的單菌落純化, 保存在SDAY斜面上。

1.5 活性菌株的篩選

1.5.1 指示菌菌液的制備

從已活化好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上挑取一環(huán)指示菌, 接入到營(yíng)養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基中, 28℃培養(yǎng)24 h, 即得指示菌菌液。采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定指示菌液所含活菌數(shù), 并將其稀釋成密度為1×105CFU/mL的菌液, 備用。

1.5.2 活性菌株的初篩

采用菌餅法[13]。用直徑 8 mm的打孔器分別在生長(zhǎng) 7 d的海洋真菌菌落邊緣和空白真菌培養(yǎng)基上制備菌餅, 然后將菌餅分別置于涂有病原指示菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基上, 以空白真菌培養(yǎng)基的菌餅作對(duì)照, 于28℃培養(yǎng)24 h, 觀察抑菌圈的有無(wú), 以初步篩選抑菌活性菌株。

1.5.3 海洋真菌發(fā)酵液的獲得

挑取初篩具有抑菌活性的菌株, 用 SDAY斜面培養(yǎng)基活化后, 分別接種至200 mL改良CA、PDA真菌發(fā)酵培養(yǎng)基中, 于28℃、140 r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)10 d后取出, 5 000 r/min離心10 min, 除去菌絲體即得發(fā)酵液, 0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌后備用。

1.5.4 活性菌株的復(fù)篩

采用打孔擴(kuò)散法[14]。用移液槍吸取指示菌菌液（1×105CFU/mL）100 μL, 涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基上, 用直徑8 mm的打孔器在培養(yǎng)基上打孔, 向孔中注入200 μL過(guò)濾后的海洋真菌發(fā)酵液, 28℃培養(yǎng)24 h, 游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小, 以空白發(fā)酵培養(yǎng)液為對(duì)照。

1.6 菌株 NJ0104抑菌活性物質(zhì)部分理化性質(zhì)

為了分離純化 NJ0104菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物中的抑菌活性物質(zhì), 有必要對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行初步研究。取NJ0104菌株的改良PDA發(fā)酵培養(yǎng)液適量, 5 000 r/min離心10 min后, 分別收集上清液和菌絲體, 備用。

1.6.1 抑菌活性物質(zhì)萃取實(shí)驗(yàn)

取10 mL上清液5份, 分別加入10 mL極性大小不同的正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、環(huán)己烷和石油醚, 置磁力攪拌器上緩慢攪拌均勻后靜置過(guò)夜, 分別收集有機(jī)相、水相。用氮吹儀分別將有機(jī)相、水相濃縮（除去有機(jī)溶劑）后, 無(wú)菌水定容至原上清液的體積, 測(cè)定抑菌活性, 以副溶血弧菌為指示菌, 未加任何有機(jī)溶劑的原上清液為對(duì)照。

菌絲體用 30 mL丙酮提取過(guò)夜, 離心后取上清液, 用氮吹儀濃縮（除去丙酮）后, 無(wú)菌水調(diào)整至原上清液的體積, 測(cè)定抑菌活性, 以副溶血弧菌為指示菌, 未加任何有機(jī)溶劑的原上清液為對(duì)照。

1.6.2 熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

取10 mL上清液18份, 隨機(jī)分為6組, 每組設(shè)3個(gè)重復(fù), 其中5組分別在40、60、80、100℃的水浴中加熱30 min及121℃高壓處理30 min, 冷卻后測(cè)定抑菌活性, 以副溶血弧菌為指示菌, 未經(jīng)加熱的原上清液為對(duì)照組。

1.6.3 紫外穩(wěn)定性試驗(yàn)

取10 mL上清液21份, 隨機(jī)分為7組, 每組設(shè)3個(gè)重復(fù), 其中6組分別置于直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中, 在20 W紫外燈下約60 cm處分別照射10、20、30、40、50、60 min后測(cè)定抑菌活性, 以副溶血弧菌為指示菌, 未經(jīng)紫外照射處理的原上清液為對(duì)照組。

1.6.4 pH穩(wěn)定性試驗(yàn)

取10 mL上清液39份, 隨機(jī)分為13組, 每組設(shè)3個(gè)重復(fù), 其中12組用1 mol/L的HCl或NaOH溶液分別調(diào)整pH值至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12, 4℃放置1 d后, 調(diào)回pH值至7.0, 并用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液調(diào)整每份至等體積后測(cè)定抑菌活性, 以副溶血弧菌為指示菌, 未經(jīng)pH調(diào)整的原上清液為對(duì)照組。

1.7 數(shù)據(jù)分析與處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件11.5進(jìn)行單因素方差分析,差異顯著者再做LSD多重比較, 顯著水平為P＜0.05,數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)誤差表示, Origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋真菌的分離

從15個(gè)海洋沉積物樣品中共分離到真菌78株,其中從M1站位中分離到的海洋真菌數(shù)量最多, 占總數(shù)量的37.2%; M3次之, 分離比例為25.4%; M2、M4和M5共計(jì)為37.4%。分析其原因可能是養(yǎng)殖區(qū)餌料的殘留、生物體代謝廢物及尸體相對(duì)集中, 形成了該區(qū)豐富的腐殖質(zhì), 并隨潮汐擴(kuò)散到養(yǎng)殖區(qū)附近區(qū)域,為海洋真菌的生存和繁殖提供了充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

2.2 抑菌活性菌株的篩選

采用菌餅法對(duì)分離到的海洋真菌菌株進(jìn)行抑菌活性初篩, 共有19株真菌對(duì)一種或者幾種病原指示菌有抑制作用, 占分離總數(shù)的24.4%。采用A、B兩種培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)上述具抑菌活性的菌株, 打孔擴(kuò)散法進(jìn)行活性測(cè)定, 結(jié)果表明: 共有9株真菌的代謝產(chǎn)物對(duì)至少一種病原指示菌有抑菌活性（表 1）, 其中有5株真菌可抑制至少3種指示菌; 菌株NJ0101、NJ0104同時(shí)對(duì)副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌、惡臭假單孢菌有抑制作用, 具有較廣的抑菌譜。相同培養(yǎng)條件下, 同一菌株經(jīng)兩種不同培養(yǎng)基發(fā)酵后,表現(xiàn)出的抑菌活性有顯著的差異, 菌株NJ0104在B培養(yǎng)基中產(chǎn)生抑菌活性次級(jí)代謝產(chǎn)物, 發(fā)酵液表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌能力, 相同培養(yǎng)條件下在 A培養(yǎng)基中的發(fā)酵液并無(wú)抑菌活性; 菌株NJ0124在A培養(yǎng)基中的發(fā)酵液有抑菌活性; NJ0101、NJ0137等7個(gè)菌株在 A、B兩種培養(yǎng)基中均能產(chǎn)生抑菌活性代謝產(chǎn)物,但其抑菌譜及抑菌活性強(qiáng)弱不同。

海洋真菌NJ0104在B培養(yǎng)基中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)除燦爛弧菌之外的6種指示菌均有抑制作用,尤其對(duì)副溶血弧菌具有很強(qiáng)的抑制活性, 抑菌圈直徑達(dá)到25.70 mm（圖 2）。

表1 海洋真菌發(fā)酵液對(duì)幾種不同指示菌的抑菌活性Tab. 1 Antibacterial activities of fungal fermentation broths against different indicator bacteria

圖2 海洋真菌NJ0104對(duì)副溶血弧菌的抑制作用Fig. 2 The inhibition ofV. parahaemolyticusby marine fungi NJ0104

2.3 菌株 NJ0104發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)的部分理化性質(zhì)

2.3.1 抑菌活性物質(zhì)萃取實(shí)驗(yàn)

采用石油醚、環(huán)己烷、正丁醇、氯仿、乙酸乙酯萃取抑菌活性物質(zhì), 結(jié)果如表2所示。

表2 有機(jī)相和水相的抑菌圈直徑Tab. 2 Inhibitory zone diameters of the organic phase and aqueous phase

該物質(zhì)難溶于極性較小的有機(jī)溶劑如石油醚、環(huán)己烷和氯仿, 微溶于乙酸乙酯, 正丁醇能較好地萃取抑菌活性物質(zhì), 故可采用正丁醇為萃取溶劑以提取抑菌活性物質(zhì)。

用丙酮對(duì)菌絲體進(jìn)行提取, 提取液不顯示抑菌活性, 表明抑菌活性物質(zhì)不存在于菌絲體中。

2.3.2 熱穩(wěn)定性

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示, 溫度對(duì)活性物質(zhì)的抑菌能力有顯著影響（P＜0.01）, 與 0℃（對(duì)照組）相比, 40℃時(shí)抑菌圈直徑?jīng)]有明顯變化, 無(wú)顯著差異（P=0.214）,其他處理組的抑菌圈直徑均明顯變小, 且差異極顯著（P＜0.01）, 各處理組之間也存在極顯著差異（P＜0.01）。

活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性如圖 3所示, 當(dāng)溫度為 60℃時(shí), 抑菌圈直徑為 24.87 mm, 殘留活性仍能達(dá)到96%以上; 當(dāng)溫度超過(guò) 80℃以上時(shí)對(duì)活性物質(zhì)的穩(wěn)定性影響較大, 抑菌效果變差, 在 121℃時(shí)徹底失去活性。表明抑菌活性物質(zhì)在 80℃以下具有良好的熱穩(wěn)定性。

2.3.3 紫外穩(wěn)定性

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示, 紫外照射對(duì)抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性有顯著影響（P＜0.01）。與對(duì)照組相比, 各處理組的抑菌圈直徑有明顯下降, 且差異顯著（P＜0.01）; 各處理組之間也存在顯著差異（P＜0.01）。

如圖4所示, 當(dāng)照射時(shí)間為30 min時(shí), 活性物質(zhì)的抑菌能力基本穩(wěn)定, 仍能達(dá)到 80%以上, 但在40 min后, 活性明顯下降, 紫外照射50 min時(shí)徹底失去活性。表明抑菌活性物質(zhì)在紫外照射40 min內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

圖3 抑菌活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性Fig. 3 Thermal stability of antibacterial substances

圖4 抑菌活性物質(zhì)的紫外穩(wěn)定性Fig. 4 Stability of antibacterial substances after incubation under UV light for different times

2.3.4 pH穩(wěn)定性

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明, 在不同pH條件下, 活性物質(zhì)的抑菌能力有顯著差異（P＜0.01）。與對(duì)照相比, pH值為 7.0時(shí), 抑菌活性無(wú)顯著差異（P=0.401）; 在其他的pH 條件下, 抑菌能力明顯下降, 且差異極顯著（P＜0.01）; 各處理組之間也存在極顯著差異（P＜0.01）。

活性物質(zhì)的pH穩(wěn)定性如圖5所示, 抑菌活性隨

圖5 抑菌活性物質(zhì)的pH穩(wěn)定性Fig. 5 Stability of antibacterial substances at different pHs

著pH值的變化呈現(xiàn)先增大后減小的改變, pH 4.0時(shí)抑菌圈直徑為21.62 mm, 與對(duì)照組接近, pH 7.0時(shí)最強(qiáng), pH 10.0時(shí)活性完全喪失。說(shuō)明活性物質(zhì)在 pH 4.0～7.0條件下相對(duì)穩(wěn)定, 對(duì)強(qiáng)酸和堿比較敏感, 分離純化時(shí)應(yīng)避免強(qiáng)酸和堿性環(huán)境。

3 討論

3.1 適當(dāng)?shù)那疤幚砑昂线m的培養(yǎng)基可以增加微生物的種類和數(shù)量[15]。目前分離海洋真菌的培養(yǎng)基主要是借鑒陸地真菌的常用分離培養(yǎng)基。楊遠(yuǎn)航等[12]認(rèn)為, 加入底泥浸出液的培養(yǎng)基所培養(yǎng)出來(lái)的真菌數(shù)量高于不加底泥浸出液的培養(yǎng)基。因此本實(shí)驗(yàn)采用添加有海洋真菌生境的海泥浸出液的培養(yǎng)基來(lái)分離真菌, 同時(shí)采用聚山梨酯?80做分散劑, 以促使海洋真菌從沉積物樣品中釋放出來(lái)。

3.2 對(duì)不同海域沉積物中海洋真菌的抑菌活性代謝產(chǎn)物的研究國(guó)內(nèi)已有一些報(bào)道[16,7]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)分離自南麂島海域沉積物樣品中的78株真菌的抑菌活性測(cè)定結(jié)果表明, 9株真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)一種或者幾種指示菌有抑菌活性, 尤其值得注意的是有些菌株顯示很高抑菌活性, 表明該海域的沉積物中分布著豐富的真菌資源, 是開(kāi)發(fā)抗菌藥物的天然寶庫(kù)。在這些產(chǎn)抑菌活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的海洋真菌中, 有 7.8%的菌株對(duì)鰻弧菌有抑制作用, 3.8%的菌株對(duì)副溶血弧菌有抑制作用, 這與黃耀堅(jiān)和Christophersen的研究結(jié)果基本一致[10,17]。

3.3 復(fù)篩所得的抑菌活性菌株的數(shù)量遠(yuǎn)低于初篩,造成此結(jié)果的主要原因可能有以下兩點(diǎn): （1）初篩過(guò)程中, 一些菌株的抑菌現(xiàn)象是由于營(yíng)養(yǎng)或空間競(jìng)爭(zhēng)造成的假陽(yáng)性結(jié)果[18]; （2）菌株在所試的發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下不產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)或產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)濃度太低在所試的條件下觀察不到抑菌現(xiàn)象。發(fā)酵培養(yǎng)基不僅會(huì)影響菌體的生長(zhǎng), 還會(huì)改變微生物代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和類型[19-20]。如在活性篩選時(shí),同樣條件下, 菌株NJ0104采用B培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)顯示較強(qiáng)的抑菌活性, 但采用A培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)沒(méi)有活性。可見(jiàn), 不同的發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)海洋沉積物真菌活性代謝產(chǎn)物的合成有較大的影響。因此在后期的篩選工作中將選擇多種培養(yǎng)基同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵, 以提高活性菌株的篩選得率。

3.4 抗生素藥物的長(zhǎng)期濫用導(dǎo)致了病原菌耐藥性增強(qiáng), 使常規(guī)抗生素在治療相關(guān)性疾病時(shí)失效、水產(chǎn)品藥物殘留問(wèn)題日益突出, 從天然產(chǎn)物中尋找安全有效地防治海洋生物弧菌病的替代藥物已是迫在眉睫。本研究篩選出能夠產(chǎn)生抑制病原指示菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的海洋真菌9株, 其中菌株NJ0104的次級(jí)代謝產(chǎn)物不但抑菌譜廣, 而且對(duì)副溶血弧菌的抑菌活性極其明顯, 對(duì)海洋生物弧菌病的防治具有一定的意義。菌株NJ0104的抑菌活性物質(zhì)在80℃以下、紫外線照射 40 min時(shí)穩(wěn)定性良好, pH穩(wěn)定范圍在4.0～7.0之間, 能較好地溶解于正丁醇中, 其抑菌機(jī)理以及具體活性成分的分析仍需要進(jìn)一步研究。

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Received: Feb., 23, 2010

Key words:Nanji Island; marine sediment; marine fungi; antibacterial activity; physical and Chemical properties

Abstract:From fifteen sediment samples collected from the Nanjidao sea area, 78 marine fungal strains were isolated and evaluated against seven types of pathogenic vibrio from mariculture organisms. The antibacterial screening showed that nineteen strains could inhibit at least one pathogenic vibrio, and nine of these produced antibacterial metabolites, which had activity against one or several types of pathogenic vibrio. The strain NJ0104 with wide antimicrobial spectrum had the strongest activity againstVibrioparahaemolyticus. A preliminary study of antibacterial metabolites produced by NJ0104 demonstrated that they had preferable thermal stability at 80℃,ultraviolet stability within forty minutes and pH stability at 4.0～7.0, and antibacterial substances could be well dissolved in butanol. The active ingredients and antibacterial mechanism of NJ0104 were worth further intensive study.

Isolation of antibacterial fungus from sediment of Nanji Island and properties of its metabolites

LI Shu-ping1, LIU Hui-hui1, Lü Feng-lin1, LI Jin-song2, LIU Jia-ming1,ZHAO Shu-jiang1
（1. Wenzhou Medical College, School of Environmental Science and Public Health, Wenzhou 325035, China;2. Wenzhou Medical College, School of Life Science, Wenzhou 325035, China）

X172; Q939.5

A

1000-3096（2011）02-0058-06

2010-02-23;

2010-06-14

溫州市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（Y20080092）; 浙江省科技廳面上項(xiàng)目（2009C33004）

李書(shū)平（1984-）, 女, 河南南陽(yáng)人, 碩士, 主要研究方向: 海洋微生物活性物質(zhì)的提取應(yīng)用, E-mail: lishuping19841006@126.com;趙淑江, 通信作者, 電話: 0577-86699553, E-mail: zsj62@163.com