尚永輝

（咸陽(yáng)師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 咸陽(yáng)712000）

科研與開(kāi)發(fā)

熒光光譜法研究橙皮素與牛血清白蛋白的相互作用*

尚永輝

（咸陽(yáng)師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 咸陽(yáng)712000）

采用熒光光譜技術(shù)研究了橙皮素與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)橙皮素對(duì)BSA的熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅過(guò)程，由熱力學(xué)參數(shù)焓變△r H m=-60.543 kJ·mol-1，熵變△r S m=-114.121J·mol-1均小于零,判斷橙皮素與BSA之間主要靠氫鍵和范德華力相結(jié)合,生成自由能變(△r G m)為負(fù)值,表明橙皮素與BSA的作用過(guò)程是一個(gè)自發(fā)過(guò)程;并應(yīng)用同步熒光光譜考察了橙皮素對(duì)BSA構(gòu)象的影響。

橙皮素；牛血清白蛋白；熒光光譜

Abstract:The interaction behavior between Hesperetin and Bovine Serum Albumin(BSA)was studied by fluorescence spectroscopy.The quenching constants were obtained at 292K,299 K,311K and 315t K,the results indicated that the fluorescence quenching mechanism for BSA through Hesperetin binding is likely a static quenching process.The thermodynamic parameters,enthalpy change (△r H m)and entropy change(△r S m),were calculated to be-60.543 kJ·mol-1＜0,and-114.121J·mol-1＜0,respectively,which indicated that the interaction of Hesperetin with BSA was driven mainly by hydrogen bond and Van der Walls force.The process of binding was a spontaneous process in which Gibbs free energy change(△r G m)was negative.The effect of Hesperetin on the conformation of BSA was analyzed using synchronous fluorescence spectroscopy.

Key words:Hesperetin;Bovine Serum Albumin（BSA）;fluorescence spectroscopy

藥物進(jìn)入人體首先與血清白蛋白結(jié)合，通過(guò)血漿的存儲(chǔ)和運(yùn)輸?shù)竭_(dá)受體部位產(chǎn)生藥理作用[1]。因此，從不同角度研究蛋白與藥物分子間的相互作用已成為目前藥物研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。熒光光譜法是目前研究蛋白質(zhì)與各種小分子以及離子相互作用的重要手段之一，通過(guò)研究，可獲得蛋白質(zhì)分子中熒光生色基團(tuán)結(jié)構(gòu)和所處微環(huán)境及其分布情況等信息，同時(shí)還可得到外源物質(zhì)與生物大分子相互作用的有關(guān)數(shù)據(jù)。

橙皮素（Hesperetin）屬于雙氫黃酮類化合物，能有效抑制脂肪分解，促進(jìn)DNA生物的合成，具有健胃、祛痰、鎮(zhèn)咳、利尿以及抗氧化、抗腫瘤等多種功效。實(shí)驗(yàn)在pH值為7.40的Tris-HCl介質(zhì)中運(yùn)用熒光光譜技術(shù)研究了橙皮素與BSA的相互作用，并對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行了初步分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白（Amresco.0930，分子量:65000）；橙皮素（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；pH值為7.40的Tris-HCl緩沖溶液。

以Tris-HCl緩沖溶液分別配制濃度均為1.0×10-3mol·L-1的BSA和橙皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液，兩種標(biāo)準(zhǔn)溶液均在0～4℃的冰箱中保存。實(shí)驗(yàn)所需濃度由此稀釋而得。實(shí)驗(yàn)所用其他試劑為分析純；水為雙重蒸餾水。

RF-5301型熒光分光光度計(jì)（日本島津公司）;UV-8453紫外分光光度計(jì)（日本日立公司）；HA-180MF電子分析天平（日本日立公司）;TB-85型恒溫水?。ㄈ毡緧u津公司）；pHSJ-4A pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在10mL比色管中依次加入pH值為7.40的Tris-HCl緩沖溶液 2.0mL、1.0×10-4mol·L-1BSA溶液1.00mL以及一定梯度量橙皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用雙重蒸餾水稀釋至刻線，搖勻，在一定溫度下恒溫1h后以285nm為激發(fā)波長(zhǎng)繪制300～500nm的熒光發(fā)射光譜以及Δλ=60nm，Δλ=15nm的同步熒光光譜，測(cè)定測(cè)定中光譜帶寬均為3nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光猝滅光譜

按照 1.2 方法分別測(cè)定 292，300，310，315K 溫度下橙皮素對(duì)BSA的熒光猝滅光譜，310 K的熒光光譜見(jiàn)圖1。

圖1 橙皮素對(duì)BSA熒光光譜的影響（T=310K）Fig.1 Fluorescence quenching spectra ofHesperetin-BSA(at310K)

由圖1可知，隨著橙皮素濃度的逐漸增加BSA的熒光強(qiáng)度逐漸降低，最大發(fā)射波長(zhǎng)由340nm逐漸紅移至350nm，這是由于BSA中的色氨酸和酪氨酸等殘基使其具有一定的內(nèi)源熒光，加入的外源性物質(zhì)橙皮素與BSA之間產(chǎn)生相互作用導(dǎo)致BSA的內(nèi)源熒光有規(guī)律的猝滅。

2.2 熒光猝滅機(jī)理及猝滅常數(shù)的測(cè)定

引起熒光猝滅的原因有動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種，隨溫度的升高動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程猝滅常數(shù)增大，而靜態(tài)猝滅過(guò)程猝滅常數(shù)減小，可由此判斷熒光猝滅得類型。不同溫度下橙皮素對(duì)BSA熒光猝滅方程（Stern-Volmer方程）及猝滅常數(shù)見(jiàn)表1。

表1 不同溫度下橙皮素對(duì)BSA的猝滅常數(shù)Tab.1 Stern-Volmer quenching constantatdifferent temperatures

由表1可知，隨溫度升高猝滅常數(shù)逐漸減小，表明該猝滅過(guò)程是由于以靜態(tài)猝滅為主。此外，各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)K q為2×1010L·（mol·s）-1[2]，橙皮素對(duì) BSA 的 K q 遠(yuǎn)大于該值，進(jìn)一步判斷橙皮素對(duì)BSA的熒光猝滅過(guò)程以靜態(tài)猝滅為主。

2.3 牛血清白蛋白與橙皮素結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)性質(zhì)及作用力

分子間的作用力包括氫鍵，范德華力，靜電引力，疏水作用力等，根據(jù)文獻(xiàn)[2]計(jì)算310、315K溫度下橙皮素與BSA結(jié)合作用的熱力學(xué)參數(shù)：自由能變△r G m=-25.166kJ·mol-1（310K），△r G m=-24.709 kJ·mol-1（315K），焓變△r H m=-60.543 kJ·mol-1，熵變△r S m=-114.121J·mol-1?！鱮 G m＜0表明橙皮素與BSA的相互過(guò)程為自發(fā)進(jìn)行，根據(jù)Ross等總結(jié)出的判斷生物大分子與小分子結(jié)合力性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律△r S m＜0，△r H m＜0推斷橙皮素與BSA之間的作用力以為氫鍵和范德華力為主。

2.4 橙皮素與BSA的表觀結(jié)合常數(shù)Kb以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n

小分子與大分子結(jié)合時(shí)其表觀結(jié)合常數(shù)Kb與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n由下式求出[5]:

lg[（F0-F）/F]=lg Kb+n lg[Q]

分別繪制橙皮素與 BSA 的 lg（F0-F）/F～lg[Q]的雙對(duì)數(shù)圖，根據(jù)方程的截距，斜率求得相應(yīng)的Kb和n，見(jiàn)表 2。

表2 不同溫度下，橙皮素與BSA的表觀結(jié)合常數(shù)Kb以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)nTab.2 The binding constants Kband the binding numbers n of Hesperetin-BSA atdifferent temperatures

由表2可知，橙皮素與BSA結(jié)合時(shí)的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n接近1，結(jié)合常數(shù)Kb值在高于104數(shù)量級(jí)，表明橙皮素與BSA結(jié)合可形成具有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合作用較強(qiáng)的非熒光復(fù)合物，橙皮素可以被蛋白質(zhì)運(yùn)輸和儲(chǔ)存。

2.5 同步熒光光譜

芳香氨基酸殘基的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)與其所處的環(huán)境極性有關(guān)，通過(guò)熒光發(fā)射波長(zhǎng)的改變可判斷芳香氨基酸殘基所處微環(huán)境的變化，Δλ=15nm，60nm的同步熒光光譜分別顯示酪氨酸殘基，色氨酸殘基的光譜特征[3]。固定BSA濃度為0.1×10-4mol·L-1逐步改變橙皮素的濃度繪制Δλ=15nm，Δλ=60nm的同步熒光光譜（圖略），發(fā)現(xiàn)：酪氨酸和色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度均隨著橙皮素濃度的增加而被猝滅，且熒光譜發(fā)射峰的位置均發(fā)生了微小的紅移，表明橙皮素對(duì)酪氨酸殘基，色氨酸殘基微環(huán)境疏水性降低，親水性增加[3]。此外色氨酸殘基熒光峰發(fā)射峰與BSA的熒光發(fā)射峰位置相近，且色氨酸殘基猝滅程度比酪氨酸殘基更為顯著，表明BSA的熒光主要由色氨酸殘基所貢獻(xiàn)，橙皮素與BSA的結(jié)合位點(diǎn)更接近于色氨酸殘基。

3 結(jié)論

在pH值為7.40的Tris-HCl緩沖體系中采用熒光光譜技術(shù)研究了橙皮素與BSA的相互作用。結(jié)果表明：橙皮素對(duì)BSA的熒光猝滅過(guò)程屬靜態(tài)猝滅，結(jié)合過(guò)程是靠氫鍵和范德華力相結(jié)合的自發(fā)反應(yīng)過(guò)程，應(yīng)用同步熒光光譜考察了橙皮素對(duì)BSA構(gòu)象的影響。

［1］胡艷軍，劉義，侯安新.化學(xué)學(xué)報(bào)［J］.2004，62（16）:1519-1523.

［2］安道利，李建晴，智慧，分析科學(xué)學(xué)報(bào)［J］.2008，24（3）:311-314.

［3］楊曼曼，楊頻，張立偉.科學(xué)通報(bào)［J］.1994，39（1）：31-35.

Study on the interaction between hesperetin and bovine serum album in by fluorescence spectroscopy*

SHANG Yong-hui
（School of Chemistry ＆ Chemical Engineering，Xianyang Normal University，Xianyang 712000，China）

O657.34

A

1002-1124（2011）01-0012-03

2010-11-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20975081）；陜西省教育廳科研計(jì)劃項(xiàng)目（2010JK899）；西北大學(xué)研究生交叉學(xué)科資助項(xiàng)目（07YJC09）

尚永輝（1978-），男，陜西寶雞人，碩士，講師，2002年畢業(yè)于陜西師范大學(xué)分析化學(xué)專業(yè)，主要從事藥物化學(xué)研究及教學(xué)工作。