勾 明 玥， 劉 梁， 張 春 枝

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

五倍子始載于《開寶本草》，具有斂肺降火、澀腸止瀉、固精縮尿、止汗、止血、解毒、斂瘡、收脫肛及子腸墜下等多種臨床功效[1-2]。五倍子中鞣質(zhì)以及沒食子酸等成分具有較多鄰位酚羥基的結(jié)構(gòu)，通過作為氫供體釋放出氫與環(huán)境中的自由基結(jié)合，終止自由基引發(fā)的連鎖反應(yīng)，從而阻止氧化過程的繼續(xù)傳遞和進(jìn)行，因此在生物體內(nèi)具有較強(qiáng)的清除自由基的作用， 從而產(chǎn)生抗衰老的作用[3]。同時(shí)由于自由基被清除，對自由基誘發(fā)的生物大分子損傷起到保護(hù)，維護(hù)細(xì)胞膜的流動和蛋白質(zhì)的構(gòu)象，防止輻射誘發(fā)的DNA斷裂，從而又具有抑制脂質(zhì)過氧化、心血管病、抗突變、抗癌、抗白內(nèi)障等方面的獨(dú)特作用[4-5]。李懷荊等[6]研究了五倍子水煎劑對老鼠抗衰老作用。傅乃武等[7]報(bào)道了五倍子鞣酸抑制體內(nèi)亞硝胺生成和對抗活性氧的作用。對五倍子的研究報(bào)道較多,但其抗氧化活性方面的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文對五倍子乙醇提取物的還原能力、清除DPPH自由基能力、清除超氧陰離子能力、清除羥自由基能力及抗脂質(zhì)過氧化作用進(jìn)行了研究，并與VC或VE進(jìn)行比較，從而評價(jià)其抗氧化活性，為五倍子的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原 料

五倍子,市售。

試劑：DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基)，Sigma公司；VE，Sigma公司；VC、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、鄰苯三酚、六氰合鐵酸鉀、亞甲基藍(lán)、乙二胺四乙酸二鈉、氯化亞鐵、三氯化鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉,硫代硫酸鈉、可溶性淀粉，均為分析純。

1.2 方 法

1.2.1 提取物的制備

稱取五倍子5 g，粉碎后加80%乙醇75 mL，50 ℃超聲波振蕩提取30 min，取出上清液；再加入80%乙醇75 mL超聲波振蕩提取30 min，去藥渣。兩次提取藥液合并，離心，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，干燥得五倍子提取物固體，提取率為51.8%。測定時(shí)用20%乙醇溶液將固體溶解并稀釋到相應(yīng)濃度。

1.2.2 還原力的測定

采用普魯士藍(lán)法，取1 mL樣品溶液，加pH 6.6的磷酸緩沖液2.5 mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]溶液2.5 mL，混合后在50 ℃放置20 min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液2.5 mL混合，取混合液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% 氯化鐵2.5 mL，混勻，靜置10 min，在700 nm處測定吸光度[8]。

1.2.3 清除DPPH自由基能力的測定

取1 mL樣品溶液，加入0.25 mmol/L DPPH ·的甲醇溶液，放入37 ℃水浴中反應(yīng)20 min，在514 nm測吸光度，另設(shè)不加DPPH ·溶液的空白管及不加樣品的控制管[9]。樣品對DPPH ·的清除能力(scavenging activity，SA)可表示為

SA=1-(Ai-Aj)/A0

(1)

式(1)中，Ai為加抗氧化劑后DPPH溶液的吸光度，A0為末加抗氧化劑時(shí)DPPH溶液的吸光度，Aj為浸提液在測定波長的吸光度[10]。清除能力越高，抗氧化活性越高。

采用鄰苯三酚法，取pH 8.2的Tris-HCl緩沖溶液4.5 mL，蒸餾水4.2 mL，混勻后加入30 mmol/L鄰苯三酚0.3 mL，總體積為9.0 mL，空白管用Tris-HCl溶液作參比，測得A空。另取試劑，在加入鄰苯三酚前加入不同濃度的樣品溶液2 mL，蒸餾水減少相應(yīng)體積，空白管用同樣濃度的樣品作參比，測得A樣。測反應(yīng)5 min時(shí)的吸光度值，清除率按式(2)計(jì)算[11-12]：

D=(A空-A樣)/A空

(2)

1.2.5 清除羥自由基(OH ·)能力的測定

D=(AS-A0)/(A-A0)

(3)

1.2.6 過氧化值POV法

稱取碘1.3 g及碘化鉀3.5 g溶于10 mL水中，稀釋至100 mL，搖勻，貯存于棕色瓶中，即為碘液。準(zhǔn)確量取碘液20～25 mL，加水50 mL，0.1 mol/mL鹽酸30 mL，搖勻，用0.1 mol/L Na2S2O3的標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定近終點(diǎn)(微黃色)時(shí)加0.5%淀粉指示劑30 mL，繼續(xù)滴定至終點(diǎn)(藍(lán)色消失)。取碘液21.0 mL，滴定至終點(diǎn)時(shí)消耗Na2S2O3的標(biāo)準(zhǔn)溶液22.6 mL。由2Na2S2O3+I2→2NaI+Na2S4O6計(jì)算出碘液濃度：22.6×0.1×2/21.0=0.215 2 mol/L。

(1)工作曲線。按文獻(xiàn)[15]方法得工作曲線方程為y=0.002 6x+0.008，R2=1。根據(jù)測得的吸光度值，通過查找工作曲線，可確定最終以I2在樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示的樣品的POV值。

(2)樣品測定。未培育油樣：取油樣0.05 g于50 mL容量瓶中，加入氯仿-冰醋酸混合溶劑2.5 mL，加飽和KI溶液0.20 mL，輕輕搖勻，置于暗處反應(yīng)5 min，取出后立即加水稀釋(約40 mL)，加入10 g/L的淀粉溶液0.5 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，取上層清液于553 nm處以蒸餾水為參比測定其吸光度。

空白油樣：取 95%乙醇溶液2 mL，加入6 mL植物油，混合后于60 ℃水浴2 h，剩余步驟同“未培育油樣”。

添加樣品的植物油樣品：取五倍子提取物0.05 g，溶于10 mL 95%乙醇中，溶解后取2 mL加入6 mL植物油，混合后于60 ℃水浴2 h，剩余步驟同“未培育油樣”。

(3)IR計(jì)算[16]?？寡趸阅芸捎帽容^直觀的IR表示,與其抗氧化性能成正比。樣品的POV值是指單位質(zhì)量油樣中碘的質(zhì)量。計(jì)算公式為

IR=(A-B)/(A-C)

(4)

式(4)中，A為空白油樣POV，B為添加樣品油樣POV，C為未培育油樣POV。

2 結(jié)果與討論

2.1 五倍子的還原力

以VC為陽性對照，五倍子提取物的還原力如圖1所示。在700 nm測定的吸光值越大，則表明其還原能力越強(qiáng)。由圖1可見，在所測濃度范圍內(nèi)，相同濃度的五倍子提取物和VC相比，提取物的還原能力強(qiáng)于VC，同時(shí)可以看出五倍子的還原能力隨其濃度的增加而增強(qiáng)。由此可見，五倍子有很強(qiáng)的還原能力。

圖1 五倍子提取物和VC還原力的比較

2.2 五倍子的清除DPPH自由基能力

以VC為陽性對照，清除DPPH自由基的能力結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在所測濃度范圍內(nèi)，相同濃度五倍子提取物的清除DPPH自由基能力略低于VC。當(dāng)質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，五倍子提取物清除率達(dá)89.17%，略低于VC約10%。同時(shí)可以看出，隨著五倍子提取物濃度的增加，清除能力增強(qiáng)。由此可見，五倍子提取物對DPPH自由基有較好的清除能力。

圖2 五倍子提取物和VC的DPPH自由基清除能力的比較

2.3 五倍子的清除超氧陰離子能力

圖3 五倍子提取物和VC超氧陰離子清除能力的比較

2.4 五倍子的清除羥自由基能力

以VC為陽性對照，測定其清除羥自由基(OH ·)的能力，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，在實(shí)驗(yàn)所測濃度范圍內(nèi)，相同濃度五倍子提取物的清除羥自由基能力略低于VC。當(dāng)質(zhì)量濃度為 20 μg/mL時(shí)，五倍子提取物的清除能力為27.78%，低于VC約30%。同時(shí)可以看出五倍子對羥自由基的清除能力隨濃度的增加而增強(qiáng)。由此可見，五倍子提取物有較好的清除羥自由基能力。

圖4 五倍子提取物和VC羥自由基清除能力的比較

2.5 五倍子的抗脂質(zhì)過氧化作用

以VE為陽性對照，測定其抗脂質(zhì)過氧化作用，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，相同濃度五倍子提取物的抗脂質(zhì)過氧化作用略低(約10%)于VE。五倍子抗脂質(zhì)過氧化作用隨濃度的增加而增強(qiáng)。由此可見，五倍子提取物有較好的抗脂質(zhì)過氧化作用。

圖5 五倍子提取物和VE抗脂質(zhì)過氧化作用的比較

3 結(jié) 論

采用5種方法評價(jià)了五倍子提取物的抗氧化活性。在所測濃度范圍內(nèi)，五倍子的抗氧化活性均隨其濃度的增加而增強(qiáng),同時(shí)五倍子提取物和VC(或VE)在同等濃度下，五倍子提取物的還原力和清除超氧陰離子的能力要高于VC，而清除DPPH自由基和羥自由基的能力低于VC，抗脂質(zhì)過氧化的作用低于VE。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，五倍子醇提物具有很高的抗氧化活性。

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