張春雪，閔鶴鳴，閔連秋

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，錦州 121001;2.遼寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，錦州 121001)

2-脫氧葡萄糖誘導(dǎo)大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激預(yù)處理模型的最佳劑量

張春雪1，閔鶴鳴2，閔連秋1

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，錦州 121001;2.遼寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，錦州 121001)

目的 探討2-脫氧葡萄糖(2-deoxy-glucose，2-DG)誘導(dǎo)大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型的最佳劑量。方法 選擇Wistar雄性大鼠108只，體質(zhì)量240～260 g，采用不同劑量2-DG建立大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的模型，隨機(jī)分為6組：2-DG 50、100、150、200 mg/kg組，假手術(shù)組，缺血再灌注組。2-DG組按工作濃度為50 mg/mL溶于雙蒸水腹腔注射7 d，假手術(shù)組和缺血再灌注組腹腔注射雙蒸水7 d，于腦缺血再灌注后12 h處死，對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分，采用HE染色觀察腦組織的病理形態(tài)，免疫組化法和Westernblot法測定GRP78蛋白的表達(dá)，用PCR法檢測GRP78 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 與腦缺血再灌注組相比，2-DG各劑量組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分明顯減低(P＜0.01)，而以100 mg/kg組評分減低最為明顯(P＜0.05);2-DG各劑量組能不同程度的改善大鼠腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的核深染、核固縮程度，減少細(xì)胞及間質(zhì)的水腫，使胞膜趨于清楚、形態(tài)接近正常、核仁清晰可見的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目增多，而以2-DG100 mg/kg組的效果最為明顯。2-DG各劑量組GRP78蛋白表達(dá)明顯增加，與腦缺血再灌注組比較，差異有顯著性(P＜0.01)，而以100 mg/kg劑量組的GRP78蛋白表達(dá)最高，與其他2-DG劑量組比較差異有顯著性(P＜0.05)。結(jié)論 2-DG對腦缺血再灌注所致的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其最佳劑量為100 mg/kg。2-DG具有誘導(dǎo)大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用，其最佳劑量是100 mg/kg。

2-脫氧葡萄糖;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;大鼠;模型，動物

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是人體新合成蛋白進(jìn)行折疊、組裝、翻譯后修飾和 Ca2+儲存的主要場所［1］，其生理功能易受內(nèi)外環(huán)境的變化如缺血、缺氧、Ca2+耗竭、葡萄糖/營養(yǎng)缺乏、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)異常、氧化應(yīng)激等的影響，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂及相關(guān)反應(yīng)稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 應(yīng) 激 (endoplasmic reticulum stress，ERS)［1，2］。凡是影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的因素幾乎都能引起ERS，如營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、干擾蛋白質(zhì)翻譯、影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子平衡、蛋白結(jié)構(gòu)異常以及缺氧、病毒感染、抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的藥物等。目前國內(nèi)外對ERS的研究比較多，誘導(dǎo)ERS的藥物也種類繁多，但是對其應(yīng)用的最佳劑量尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)試圖確定2-DG誘導(dǎo)大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激預(yù)處理模型的最佳劑量。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

選擇SD雄性大鼠108只，體質(zhì)量240～260 g，來源于遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心【SCXK(遼)2003-0007】。并按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。每籠2只喂養(yǎng)，動物自由飲食，在基礎(chǔ)學(xué)院2級動物實(shí)驗(yàn)室(室溫22℃，濕度45%)喂養(yǎng)一周，適應(yīng)環(huán)境后開始實(shí)驗(yàn)。藥品：2-DG購于天津致遠(yuǎn)公司;GRP78一抗、二抗購于北京博奧森試劑公司;Trizol試劑，逆轉(zhuǎn)錄酶，Tag酶等PCR試劑購于大連寶生物。LEICA-RM-2135石蠟切片機(jī)：德國萊卡;CSIV型攤片烤片機(jī)：孝感市電子儀器廠;恒溫水浴箱：湖北黃石儀器廠;BH/CH20BIMF200顯微鏡：日本奧林巴斯;CIAS-1000型圖像分析儀：北京大恒圖像視覺有限公司等。

1.2 分組與給藥

108只大鼠隨機(jī)分成6組，每組18只大鼠：假手術(shù)組、腦缺血再灌注(I/R)組、2-DG組4個(gè)劑量組(2-DG：50、100、150 和 200 mg/kg)。大鼠大腦中動脈缺血模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)的制備參照 Zea Longa［3］法并加以改進(jìn)，用線栓阻斷左側(cè)MCA的血液供應(yīng)。用10%水合氯醛(30 mg/kg)腹腔注射麻醉SD大鼠，頸部正中切口，手術(shù)顯微鏡下，暴露左側(cè)頸總動脈，分離右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)，結(jié)扎ECA的根部，用動脈夾夾閉ICA遠(yuǎn)端，在左側(cè) CCA分叉處的下方剪一小口，插入已知長度的碳素魚線(線前端預(yù)先加熱成光滑的橢圓形，直徑為(0.18±0.20)mm，去除動脈夾，緩慢推進(jìn)線栓約(18±2)mm，感到有輕微阻力時(shí)停止，扎緊結(jié)扎線并固定插線。缺血2 h后再灌注后12 h處死大鼠。2-DG的四個(gè)劑量組，分別按照 50、100、150、200 mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射，每天1次，連續(xù)7 d(將2-DG溶于雙蒸水，工作濃度為50 mg/mL);I/R組和假手術(shù)組給予相同體積的雙蒸水替代2-DG腹腔注射，每天1次，連續(xù)7 d。假手術(shù)組插入深度少于15 mm。模型成功的標(biāo)志是術(shù)后動物出現(xiàn)同側(cè) Horner＇s征及動物麻醉清醒后出現(xiàn)以左前肢為主的偏癱，評分在1～3分。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 神經(jīng)行為學(xué)評分：參考經(jīng)典的 Zea Longa［3］法對大鼠在 MCAO術(shù)后清醒后到12 h進(jìn)行3次神經(jīng)功能評分，取平均值。神經(jīng)功能缺失評分標(biāo)準(zhǔn)為：0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀，活動正常。1分：輕微神經(jīng)功能缺損，不能完全伸展對側(cè)前爪。2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損，爬行時(shí)出現(xiàn)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)(追尾現(xiàn)象)。3分：重度局灶性神經(jīng)功能缺損，行走時(shí)身體向?qū)?cè)傾斜。4分：不能自發(fā)行走，意識水平下降。

1.3.2 腦組織病理學(xué)觀察：造模后再灌注12 h大鼠以10%水合氯醛(0.3 mL/100 mg)腹腔注射麻醉，打開頸部，暴露頸右總動脈，插管，先輸注生理鹽水約50 mL，然后輸注4%多聚甲醛約50 mL，脫頸處死，取腦。甲醛固定，冠狀腦片制備，選擇梗死中心(即最大層面)，常規(guī)酒精脫水，石蠟包埋，制成4～6 mm厚的切片，附片，行蘇木素-伊紅(HE)染色，分別觀察梗死中心區(qū)、梗死周邊區(qū)腦組織(海馬CAl區(qū)、CA3區(qū))，前述區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞(每個(gè)觀察區(qū)選擇具有代表性標(biāo)本觀察結(jié)果并記錄)。

1.3.3 大鼠海馬CA1區(qū)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP78)表達(dá)的定性測定：造模后12 h，大鼠以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉后固定，頸正中偏右切口，暴露右頸總動脈，用NS約50 mL灌注，然后用4℃4%多聚甲醛液約50 mL灌注固定，4 h脫頸處死，取腦，取雙側(cè)大腦冠狀位距嗅球尖端6～11 mm的腦組織塊，放入4%多聚甲醛固定液中繼續(xù)固定24 h，常規(guī)梯度脫水、透明、石蠟包埋。從冠狀面中1/3層面開始留取切片。厚度5 mm，連續(xù)切片，切片貼附于經(jīng)APES處理的載玻片上，備用。用免疫組化法測定。嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。觀察大鼠海馬CA1區(qū)，每張取5個(gè)視野數(shù)采用CIAS-1000型圖像分析儀計(jì)算GRP78的陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值。

1.3.4 大鼠海馬CA1區(qū)GRP78蛋白表達(dá)的定量測定：每組動物6只，用10%的水合氯醛按350 mg/kg劑量腹腔注射麻醉動物，脫頸取腦。剪碎腦組織置于裂解液中機(jī)械勻漿，4℃ 17 000 r/min離心1 h，取出上清液，棄去沉淀。用考馬斯亮藍(lán)G250結(jié)合法，根據(jù)已知牛血清白蛋白溶液的濃度及其吸光度和樣品吸光度計(jì)算樣品蛋白濃度和加樣量。加入樣品緩沖液，置于沸水浴中5 min使蛋白變性。制備7.5%分離膠和4%濃縮膠，用微量注射器將樣品加在凝膠表面的樣品槽中。電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%奶粉TTBS緩沖液振蕩封閉3 h后洗膜，分別加入一抗 GRP78、β-actin，4℃冰箱孵育一夜。洗膜，辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG HRP，室溫孵育1 h，洗膜后進(jìn)行ECL(enhanced chemiluminescence)反應(yīng)1～3 min，暗室曝光Santa Cruz，顯影后沖洗膠片。凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析測定目標(biāo)帶的DV(integrated density value)，計(jì)算出各組目標(biāo)帶與 β-actin DV比值。

1.3.5 大鼠海馬CA1區(qū)GRP78 mRNA表達(dá)的測定：總RNA的提取按Trizol試劑盒說明進(jìn)行。按試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增體系：10×Taq buffer 2 μL，25 mol/L Mgcl21 μL，dNTP 1 μL，上下游引物各 1 μL，cDNA 1 μL，Taq 酶 0.2 μL，超 純 水12.8 μL。利用引物 5′-ATAATCAGCCCACCGTAA-3′和 5′-CCAATTCATTCCTCGTGT-3′擴(kuò) 增 330 bp 的GRP78片段，利用引物 5′-CCTAAGGCCAACCGTGAA-3′和 5′-AGCCAGGGCAGTAATCTC-3′擴(kuò) 增 630 bp的 β-actin。GRP78擴(kuò)增條件：94℃ 5 min預(yù)變性，94℃ 變性 50 s，54℃復(fù)性 50 s，72℃ 延伸 50 s，30個(gè)循環(huán)，最后經(jīng)72℃延長10 min終止反應(yīng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分

各組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分分別為：假手術(shù)組：0.00±0.00，腦缺血再灌注組：(3.33 ±0.52)，2-DG 50、100、150、200 mg/kg 依次為：(2.00 ± 0.63)、(1.33±0.52)、(2.00±0.63)、(2.17±0.75)。與假手術(shù)組比較，腦缺血再灌注組和2-DG各劑量組的神經(jīng)行為學(xué)評分具有顯著性差異(P＜0.01);與腦缺血再灌注組比較，2-DG各劑量組的神經(jīng)行為學(xué)評分減低，差異具有顯著性(P＜0.01)，與其他2-DG劑量組比較，100 mg/kg劑量組的神經(jīng)行為學(xué)評分最低(P＜0.05)。

2.2 大鼠腦海馬CA1區(qū)組織病理形態(tài)學(xué)變化

HE染色(×400)光學(xué)顯微鏡下觀察，假手術(shù)組見正常神經(jīng)元核圓形，邊界及核仁清楚。腦缺血再灌注組和2-DG各劑量組均可見正常神經(jīng)元和損傷神經(jīng)元：正常神經(jīng)元核圓形，邊界及核仁清楚;損傷神經(jīng)元胞核腫大，偏位，核仁消失，胞質(zhì)著色淺、蒼白或核濃縮、深染，細(xì)胞呈三角形缺血性壞死變化;損傷神經(jīng)元上述特點(diǎn)在腦缺血再灌注組表現(xiàn)得更明顯。與假手術(shù)組比較，腦缺血再灌注組和2-DG組可見損傷細(xì)胞數(shù)目增多，與腦缺血再灌注組比較，2-DG各劑量組能不同程度的改善神經(jīng)細(xì)胞的核深染、核固縮程度，減少細(xì)胞及間質(zhì)的水腫，使胞膜清楚，形態(tài)正常，核仁清晰可見的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目增多;與2-DG的其他劑量組相比較，2-DG 100 mg/kg組改善神經(jīng)細(xì)胞的核深染、核固縮程度更加明顯，細(xì)胞及間質(zhì)的水腫明顯減輕，胞膜清楚，形態(tài)正常，核仁清晰可見的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目增多。見圖1(彩插8)。

2.3 各組大鼠海馬CA1區(qū)GRP78蛋白的陽性表達(dá)

與假手術(shù)組比較，腦缺血再灌注組和2-DG各劑量組的GRP78蛋白表達(dá)差異具有顯著性(P＜0.01);與腦缺血再灌注組比較，2-DG各劑量組的GRP78蛋白表達(dá)差異均具有顯著性(P＜0.01)，而以100 mg/kg劑量組最為明顯(P＜0.05)見表1。

2.4 各組大鼠海馬CA1區(qū)GRP78蛋白的定量表達(dá)

與假手術(shù)組相比，腦缺血再灌注組和2-DG各劑量組GRP78蛋白表達(dá)均增高，差異有顯著性(P＜0.01);與腦缺血再灌注組比較，2-DG各劑量組更為明顯(P＜0.01)，而 2-DG 100 mg/kg組 GRP78蛋白表達(dá)最高(P＜0.05)。見圖2和表1。

圖2 GRP78蛋白的檢測結(jié)果Fig.2 The results of GRP78 protein detection

2.5 各組大鼠海馬CA1區(qū)GRP78 mRNA的表達(dá)

與假手術(shù)組比較，腦缺血再灌注組和2-DG各劑量組GRP78mRNA表達(dá)差異有顯著性(P＜0.01)，與腦缺血再灌注組比較，2-DG各劑量組差異有顯著性(P＜0.01)，而2-DG 100 mg/kg組 GRP78 mRNA表達(dá)最高，與其他2-DG各劑量組比較差異具有顯著性(P＜0.05)。見圖3和表1。

圖3 GRP78mRNA檢測結(jié)果Fig.3 The results of GRP78 mRNA detection

表1 2-DG對腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)海馬CA1區(qū)GRP78陽性細(xì)胞表達(dá)的影響Tab.1 The effect of 2-DG on GRP78-expression positive cells in the ischemic hippocampal CA1 area at the ischemic side

3 討論

預(yù)處理(preconditioning，PC)是指在嚴(yán)重缺血之前給予的各種保護(hù)性的/干預(yù)性措施，包括缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning，IP)、升高體溫、藥物干預(yù)、高壓氧等，其中IP是常用方法。IP是指對腦預(yù)先進(jìn)行一次或多次短暫的非致死性缺血刺激后，機(jī)體獲得對更嚴(yán)重甚至致死性腦缺血的耐受性，表現(xiàn)為腦細(xì)胞死亡明顯減少，梗死范圍大幅縮小、器官功能障礙明顯減輕等。這種IP誘導(dǎo)腦組織對隨后的腦缺血性損傷產(chǎn)生遲發(fā)性的抵抗能力的現(xiàn)象稱為腦缺血耐受［5-8］

預(yù)處理是目前細(xì)胞保護(hù)的一大策略［7］，主要涉及缺血預(yù)處理、藥物預(yù)處理和低氧預(yù)處理等。鑒于輕度的ERS可促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對蓄積在網(wǎng)腔內(nèi)的錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白的處理，有利于維持細(xì)胞的正常功能并使之存活［9］，提示ERS預(yù)處理可以作為一種細(xì)胞保護(hù)的新策略，在 ERS相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用。

2-DG是一種常見的不可代謝的葡萄糖衍生物，動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2-DG能誘導(dǎo)GRP78的表達(dá)上調(diào)，抑制癲癇發(fā)作，而且沒有觀察到任何的副作用［10，11］。它可以迅速進(jìn)入腦通過己糖激酶途徑后以較為穩(wěn)定的6-磷酸-2-DG的形式積累，后者可以抑制腦細(xì)胞內(nèi)糖的氧化［12］;同時(shí) 6-磷酸-2-DG 很難被代謝，可持續(xù)性抑制葡萄糖，干擾蛋白質(zhì)的糖基化［13］。糖基化是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)新蛋白合成和分泌的關(guān)鍵步驟，其過程受阻導(dǎo)致未折疊和錯(cuò)折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積累，觸發(fā)ERS，是ERS的誘導(dǎo)劑，但其最佳劑量還未確定。

GRP78在ERS時(shí)表達(dá)異常增高，可以看作ERS的標(biāo)志性蛋白［14］，可促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白正確折疊、修飾，具有保護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的作用。GRP78還具有維持細(xì)胞內(nèi)鈣平衡的作用［15］。因此，GRP78在應(yīng)激條件下對細(xì)胞起保護(hù)作用。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，與腦缺血再灌注組相比，2-DG各劑量組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分明顯減低(P＜0.01)，而以100 mg/kg組評分減低最為明顯(P＜0.05);同時(shí)亦發(fā)現(xiàn)，2-DG各劑量組能不同程度的改善大鼠腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的核深染、核固縮程度，減少細(xì)胞及間質(zhì)的水腫，使胞膜趨于清楚、形態(tài)接近正常、核仁清晰可見的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目增多，而以2-DG 100 mg/kg組的效果最為明顯。提示2-DG對腦缺血再灌注所致的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其最佳劑量為100 mg/kg。

研究發(fā)現(xiàn)，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物的分子伴侶GRP78可促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白正確折疊、修飾，具有保護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的作用，在 ERS時(shí)表達(dá)上調(diào)，可以看作 ERS的標(biāo)志性蛋白［16，17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2-DG各劑量組GRP78蛋白表達(dá)明顯增加，與腦缺血再灌注組比較，差異有顯著性(P＜0.01)，提示神經(jīng)元發(fā)生了 ERS;而以100 mg/kg劑量組的GRP78蛋白表達(dá)最高，與其他2-DG劑量組比較差異有顯著性(P＜0.05)。提示2-DG具有誘導(dǎo)大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用，其最佳劑量是100 mg/kg。

(本文圖1見彩插8。)

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Optimization of the dosage of 2-deoxy-glucose in the establishment of a mouse model of endoplasmic reticulum stress

ZHANG Chun-xue1，MIN He-ming2，MIN Lian-qiu1
(1.Department of Neurology，the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China;2.College of Basic Medicine，Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China)

Objective To explore the optimal dosage of 2-deoxy-glucose(2-DG)in the establishment of a mouse model of endoplasmic reticulum stress.Methodes 108 healthy male SD rats were choosen and randomly divided into 6 groups： sham-operation group，ischemia-reperfusion group，2-DG 50 mg/kg group，2-DG 100 mg/kg group，2-DG 150 mg/kg group，2-DG 200 mg/kg group，using different dosage of 2-DG to set up models of endoplasmic reticulum stress.2-DG was dissolved in double distilled water on working concentration of 50 mg/mL and injected into the rat abdomen for 7 days.The sham-operation and ischemia-reperfusion groups were injected with distilled water instead of 2-DG.After ischemia-reperfusion for 12 h，the rats were killed and the neurological function of each group was evaluated and，the pathological changes were observed with HE staining，and the expression of GRP78 was detected by immunohistochemistry and Western blot.The expression of GRP78 mRNA was detected by RT-PCR.Results The scores of 2-DG groups were significantly decreased compared with that in the sham-operation and ischemia-reperfusion group(P＜0.01)，and that of the 2-DG 100 mg/kg group decreased more obviously(P ＜0.05).The 2-DG treatment improved the nerve cell damage，depicting cell membranes more clearly，forming normal cell appearance，and increased number of visible nucleoli in neurons.The improvement in the 2-DG 100 mg/kg group was most significant.The expression of GRP78 was significantly increased in 2-DG groups in comparison with the ischemia-reperfusion group(P ＜0.01).Furthermore，the expression of GRP78 protein in the 2-DG100 mg/kg group was most increased compared with that in other 2-DG groups.Conclusions 2-DG has protective effect on cerebral ischemia-injured neurons and can induce endoplasmic reticulum stress in rat brain at the best dose of 100 mg/kg.

2-deoxyglucose;Endoplasmic reticulum stress;Rats;Animal model

Q95-33，R-33

A

1005-4847(2011)01-0074-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.01.017

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.20092192)。

張春雪，女，碩士研究生，E-Mail：zhangchunxue@yahoo.com.cn。

閔連秋，男，教授，主任醫(yī)師。研究方向：腦血管疾病的基礎(chǔ)與臨床。E-mail：minlianqiu@163.com。

2010-09-25