關(guān) 水， 劉 天 慶＊， 葛 丹， 陸 瑞 欣， 馬 學(xué) 虎， 崔 占 峰

（1.大連理工大學(xué) 大連市干細(xì)胞與組織工程研發(fā)中心，遼寧 大連 116024；2.牛津大學(xué) 工程科學(xué)系，英國 牛津 DX1 3PJ）

0 引 言

神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）體外分離培養(yǎng)的成功及神經(jīng)生物學(xué)發(fā)育機(jī)制的深入研究，為腦損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能重建、神經(jīng)再生和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了新的思路和途徑，因此在細(xì)胞移植、藥物篩選、轉(zhuǎn)基因治療及組織工程等方面有著巨大的應(yīng)用價(jià)值［1～4］.但是目前對于NSCs的體外培養(yǎng)主要還是采用傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)方式：一種是以神經(jīng)球（neurosphere）在培養(yǎng)器皿中懸浮（suspension）培養(yǎng)，另一種是在經(jīng)過處理的培養(yǎng)器皿的表面單層貼壁（monolayer）培養(yǎng)［5、6］.細(xì)胞由于脫離體內(nèi)真實(shí)環(huán)境而影響生物學(xué)行為，因而直接影響了NSCs的數(shù)量和活性.體內(nèi)細(xì)胞都是在三維空間中生長、繁殖、分化并發(fā)揮其特定的生物學(xué)功能的.體外細(xì)胞培養(yǎng)的一個重要原則是要最大程度地模擬體內(nèi)細(xì)胞生長環(huán)境.不同于傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)方式，三維培養(yǎng)（three－dimensional culture）是將細(xì)胞種植在一定的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）中，ECM蛋白充當(dāng)生長支架，為細(xì)胞提供三維的結(jié)構(gòu)支承，使細(xì)胞間形成適宜的空間分布和細(xì)胞連接，而且為細(xì)胞提供特異性的生長和分化信號，形成與體內(nèi)組織相似的細(xì)胞生長微環(huán)境，從而引導(dǎo)組織形成［7、8］.

三維培養(yǎng)是組織工程中最典型的培養(yǎng)方式，在細(xì)胞擴(kuò)增、組織構(gòu)建等方面具有重要作用.近幾年來，采用具有三維結(jié)構(gòu)的支架材料進(jìn)行NSCs的培養(yǎng)已取得了成功［9～11］.2000年，O′connor等將NSCs接種到Ⅰ型膠原凝膠中實(shí)現(xiàn)三維培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)NSCs能夠在膠原凝膠中增殖并分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞［10］；2004年，Ma等進(jìn)一步研究證明，在三維膠原凝膠中，NSCs可以分化為有功能的神經(jīng)環(huán)路，產(chǎn)生的神經(jīng)元具有神經(jīng)元極性、神經(jīng)遞質(zhì)、離子通道感受器及興奮性的功能［11］.目前國內(nèi)外對于NSCs三維培養(yǎng)的研究仍處于初級階段，且大多采用膠原作為支架材料，但是純膠原延展性較低，易干裂，抗水性差，遇水易溶脹降解，因此需要通過一定的改性提高膠原的拉伸強(qiáng)度及抗降解能力，從而改善膠原的力學(xué)性能與抗水性，以更適合NSCs生長的微環(huán)境.殼聚糖作為一種天然多糖衍生物，具有優(yōu)良的生物親合性，其分子鏈上豐富的羥基和氨基，可發(fā)生多種化學(xué)反應(yīng)［12］.殼聚糖與膠原結(jié)合能夠形成大分子聚電解質(zhì)復(fù)合材料，可以提高膠原的力學(xué)強(qiáng)度，并且可以延遲膠原的降解時間.因此本文針對膠原支架本身存在的不足，采用冷凍干燥法制備膠原－殼聚糖復(fù)合支架，建立體外NSCs的三維培養(yǎng)，同時考察NSCs與膠原－殼聚糖復(fù)合支架的生物相容性.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試劑 實(shí)驗(yàn)所用試劑如下：鼠尾Ⅰ型膠原（CultrexTM，Trevigen Inc.）；殼聚糖（上海伯奧生物科技有限公司）；DMEM 培養(yǎng)液 （Gibco）；RPMI－1640培養(yǎng)液（Sigma）；F12（Gibco）；胎牛血清（華美生物工程公司）；D－葡萄糖 （Gibco）；胰蛋 白 酶 （Gibco）；N2 添 加 劑 （Gibco）；EGF（Gibco）；bFGF （Gibco）；HEPES（Roche）；GlutaMax－1（Gibco）；Heparin（Gibco）；Lipid（Gibco）；B27（Gibco）；BSA（Gibco）；AccutaseTM酶 （Sigma）；Live／Dead Viability－Cytotoxicity Kit（Invitery，USA）.其他所有常規(guī)試劑均為分析純.

1.1.2 儀器 實(shí)驗(yàn)所用儀器如下：超凈工作臺（CA－920－3，上海凈化設(shè)備廠）；血球計(jì)數(shù)板（XB－K－25，上海求精生化試劑儀器有限公司）；離心機(jī)（Z323，Hermle，Germany）；CO2培養(yǎng)箱（HERA cell，Kendro Laboratory Products，Germany）；超純水機(jī)（Millipore－Q－Synthesis，F(xiàn)rance）；水浴振蕩器（SHA－C，江蘇安普電子工程有限公司）；高壓 滅 菌 器 （SS－325，Tomy Kogyo Co.Ltd.，Japan）；冷凍干燥機(jī)（Labconco，USA）；掃描電子顯微鏡（S2520，Hitachi，Japan）；熒光倒置顯微鏡（IX70－131，Olympus Optical Co.Ltd.，Japan）；FV1000激光共聚焦掃描顯微鏡（Olympus Optical Co.Ltd.，Japan）.

1.1.3 細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)取孕14d的昆明小鼠（購自大連醫(yī)科大學(xué)），按照實(shí)驗(yàn)室以前文獻(xiàn)報(bào)道的方法［13、14］獲取神經(jīng)干細(xì)胞、進(jìn)行原代及傳代培養(yǎng).培養(yǎng)基由 DMEM／F12（1∶1）和 RPMI－1640按比例混合作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加生長因子及其他成分構(gòu)成（其中 EGF，20ng·mL－1；bFGF，10 ng·mL－1；Heparin，4mg· mL－1；HEPES，5 mmol／L；D－葡萄糖，9.151g·L－1；GlutaMax－1，4.5mmol／L；BSA，2mg·mL－1；加適量NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.2）.本實(shí)驗(yàn)采用第三代細(xì)胞.

1.2 方 法

1.2.1 支架制備、交聯(lián)及修飾

（1）制備

稱取一定質(zhì)量的殼聚糖粉末，完全溶解于2%的乙酸，配制成20mg／mL殼聚糖溶液，離心除渣脫泡待用；膠原（CultrexTM，溶解于20 mmol／L乙酸中）儲存于2～8℃待用，儲備液的濃度為5mg／mL.分別將膠原與殼聚糖溶液按體積比9∶1、7∶3、5∶5充分混勻，離心除泡后加入預(yù)冷的96孔板中（每孔100μL），置于－84℃超低溫冰箱內(nèi)預(yù)凍2h后迅速轉(zhuǎn)移至低溫冷凍干燥機(jī)中12h，再浸入0.1mol／L Na2HPO4（pH 7.4）中數(shù)小時以中和殘留的乙酸，然后用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性，再冷凍干燥8h，即得殼聚糖－膠原復(fù)合支架.

（2）交聯(lián)

將凍干后的支架小心取出，轉(zhuǎn)移至24孔板內(nèi)，加入2mL含50mmol／L 2－嗎啉乙烷磺酸、50 mmol／L碳化二亞胺及50mmol／L N－羥基琥珀酰亞胺的體積分?jǐn)?shù)為0.4的乙醇交聯(lián)劑中室溫交聯(lián)6h，移去交聯(lián)劑，加入0.1mol／L Na2HPO4（pH 7.4）室溫孵育2h，再用體積分?jǐn)?shù)為0.4的乙醇清洗4次，30min／次，雙蒸水反復(fù)洗至中性，最后將24孔板置于超低溫冰箱內(nèi)預(yù)凍2h，再次冷凍干燥，即得交聯(lián)后的支架.

（3）修飾

將經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌過的交聯(lián)的膠原－殼聚糖復(fù)合支架置于24孔板內(nèi)，將100μL（10μg／mL）的層粘連蛋白（LN）小心懸滴于支架中，并將孔板置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，無菌干燥后保存?zhèn)溆?

1.2.2 支架孔徑、孔隙率、吸水率及降解率測 定

（1）孔徑（aperture）

取以上制備的不同比例的復(fù)合支架，真空噴金導(dǎo)電處理后黏貼在金屬模塊上，在掃描電子顯微鏡下觀察支架材料內(nèi)部的微觀結(jié)構(gòu).選擇合適的放大倍數(shù)拍攝掃描照片，并在材料內(nèi)部選取3個視野，每個視野測量10個孔徑值，計(jì)算支架的平均孔徑.

（2）孔隙率（porosity）［15］

測量支架的質(zhì)量，記為m0，體積記為V0，將支架浸入無水乙醇（密度為ρ0）中24h，使乙醇溶液充分進(jìn)入到支架材料中，然后小心地將支架取出，表面擦干，稱其質(zhì)量，記為m，則支架內(nèi)孔的體積Vp＝（m－m0）／ρ0，每個樣本測3 次，取平均值.支架孔隙率ε（%）按下式計(jì)算：

（3）吸水率（water absorption）

測量支架的質(zhì)量，記為m0，浸泡到三蒸水中24h后再次稱重，記為m1，每個樣本測3次，取平均值.支架吸水率A（%）按下式計(jì)算：

（4）降解率（degradation rate）

取12支20mL試管分成4組，每組3支，分別加入制備好的不同比例的干燥復(fù)合支架（質(zhì)量記為m0），再加入10mL含溶菌酶1×105U 的0.1mol／L磷酸緩沖液（pH 7.4），置于37℃水浴中振蕩消化.分別于1、2、3、4、5和6周取出各組樣本，蒸餾水洗后冷凍干燥，稱重，記為mt.支架降解率D（%）按下式計(jì)算：

1.2.3 支架內(nèi)細(xì)胞接種率的測定及分布觀察根據(jù)孔隙率選取體積比為7∶3的膠原－殼聚糖復(fù)合支架，將NSCs小心接種在支架上，細(xì)胞接種的初始濃度為5×106個／mL，體積為20μL；未經(jīng)LN處理的支架作為對照組.接種率（%）按下式計(jì)算：

培養(yǎng)4d后，加入10μg／mL Hoechst33342，置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育10 min，然后加入預(yù)冷的4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定細(xì)胞（與培養(yǎng)液按1∶3混合），10min后取出支架，用PBS蕩洗3次，用刀片切成薄片（平均厚度50～100μm），于熒光顯微鏡下觀察.

1.2.4 細(xì)胞死活檢測 細(xì)胞以5×106個／mL的初始濃度分別接種于不同體積比的膠原－殼聚糖復(fù)合支架中，體積為20μL，置于24孔板內(nèi)在37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).采用Live／Dead Viability－Cytotoxicity Kit檢測細(xì)胞在支架內(nèi)的存活.Live／Dead Viability－Cytotoxicity Kit含有測量細(xì)胞活力的兩種熒光探針.活細(xì)胞能夠與鈣黃綠素（calcein AM，4mmol／L）結(jié)合，在激發(fā)光的作用下發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光；而死細(xì)胞由于細(xì)胞膜的破損，細(xì)胞內(nèi)的核酸能夠與乙啡啶同型二聚體（EthD－1，2mmol／L）結(jié)合，在激發(fā)光的作用下產(chǎn)生強(qiáng)烈的紅色熒光.具體操作方法按照說明書進(jìn)行，采用激光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行觀察.

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 各組實(shí)驗(yàn)分別重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示，學(xué)生t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05認(rèn)為有顯著性差異.

2 結(jié)果與討論

2.1 膠原－殼聚糖復(fù)合支架的微觀結(jié)構(gòu)

本研究通過冷凍干燥法制備的膠原－殼聚糖復(fù)合支架為白色、不透明、表面粗糙，具有一定彈性的規(guī)則圓柱體（底面直徑約為6mm，高約為3 mm），有的呈纖維狀排列并有大小不等的隆起，用手觸摸感覺有彈性.圖1所示為膠原－殼聚糖復(fù)合支架（7∶3）在掃描電鏡下的超微結(jié)構(gòu)，可以非常清楚地看到支架上較大范圍內(nèi)的孔結(jié)構(gòu)，孔與孔之間相互連通形成孔道.但從圖1（a）中也可以看到，支架多孔結(jié)構(gòu)的某些區(qū)域仍然不是很均勻，這可能是由于在膠原和殼聚糖溶液混合過程中攪拌不勻產(chǎn)生了氣泡，經(jīng)預(yù)凍后形成了較大的結(jié)冰區(qū)，導(dǎo)致支架在凍干時局部冰晶直接升華，從而產(chǎn)生了所謂的“無孔區(qū)”.

圖1 膠原－殼聚糖復(fù)合支架的微觀結(jié)構(gòu)Fig.1 The microstructure of collagen－chitosan composite scaffolds

2.2 膠原－殼聚糖復(fù)合支架的性能特征

支架的孔隙形態(tài)，包括孔隙率、孔徑大小和孔徑分布等對細(xì)胞增殖速度、支架降解動力學(xué)特性和組織的力學(xué)特性等有著重要的影響.因此，組織工程中使用的支架不僅要求其材料具有生物相容性、生物可降解性，還要求具有高孔隙率、高比表面積、孔隙內(nèi)部連通性好等特性，以便于組織液擴(kuò)散和組織的形成.本實(shí)驗(yàn)所制備的不同體積比的膠原－殼聚糖復(fù)合支架的孔徑、孔隙率、吸水率、降解率等參數(shù)如表1及圖2所示.

表1 膠原－殼聚糖復(fù)合支架的孔徑、孔隙率、吸水率Tab.1 The aperture，porosity and water absorption of collagen－chitosan composite scaffolds

圖2 膠原－殼聚糖復(fù)合支架的體外降解率Fig.2 The degradation rate of collagen－chitosan composite scaffolds in vitro

由表1可以得出，隨著殼聚糖比例的增加，復(fù)合支架的孔徑逐漸減小，吸水率逐漸增大，而孔隙率沒有明顯的變化.這些結(jié)果說明通過冷凍干燥法制備的不同比例的膠原－殼聚糖復(fù)合支架，都具有較高的孔隙率（90%左右），具備孔與孔之間的連通，但是連通孔徑之間存在一定的差別.膠原比例太大，使得復(fù)合支架更加致密，孔壁變厚，孔徑變大，孔的數(shù)量減少，且分布不均.而且隨著膠原蛋白含量的增加，吸水率逐漸降低，導(dǎo)致降解速度加快.

膠原在體內(nèi)由膠原酶迅速降解，而殼聚糖則主要由體液中的溶菌酶降解.這兩種酶在體內(nèi)的含量不同，當(dāng)溶菌酶分解了包裹在膠原纖維外的殼聚糖后，膠原酶才能對膠原纖維進(jìn)行降解［16］，因此實(shí)驗(yàn)中僅采用溶菌酶考察膠原－殼聚糖復(fù)合支架的降解速率.由圖2可見，隨著時間的延長，不同體積比的膠原－殼聚糖復(fù)合支架的降解率同趨勢增加，且隨著殼聚糖比例的增加，支架的降解率呈依賴性提高，即5∶5支架的降解率明顯高于7∶3和9∶1實(shí)驗(yàn)組的.需要指出的是，生物材料的體內(nèi)降解受多種酶的聯(lián)合作用，不完全同于體外降解情況，所以膠原－殼聚糖在溶菌酶中的模擬降解只能宏觀上評價(jià)不同體積比支架的體外降解趨勢的快慢.

以上結(jié)果表明，體積比為5∶5、7∶3、9∶1的膠原－殼聚糖復(fù)合支架的孔徑、孔隙率、吸水率、降解率等實(shí)驗(yàn)參數(shù)都符合體外細(xì)胞培養(yǎng)的要求.考慮到孔徑及其均勻性的差別，在以后的實(shí)驗(yàn)中，主要采用體積比為7∶3的膠原－殼聚糖復(fù)合支架來進(jìn)行NSCs的三維培養(yǎng).

2.3 膠原－殼聚糖復(fù)合支架與NSCs的生物相容性

要實(shí)現(xiàn)NSCs在支架材料內(nèi)的三維培養(yǎng)，首先要求細(xì)胞很好地接種在支架材料上.細(xì)胞與支架材料的黏附是組織工程研究細(xì)胞與材料間相互作用的基礎(chǔ).影響?zhàn)じ降囊蛩刂饕猩飳W(xué)和材料學(xué)兩個方面.就材料學(xué)方面來說，材料表面的親疏水性、表面自由能、荷電特性等對材料的黏附性都存在較大的影響.細(xì)胞和膠原－殼聚糖支架的結(jié)合在很大程度上依靠糖蛋白的連接.層粘連蛋白（LN）能夠?yàn)榧?xì)胞在支架上的黏附提供良好的基質(zhì)膜環(huán)境，提高細(xì)胞與支架的黏附率.NSCs能夠連結(jié)LN的第11位氨基酸，再由LN短臂上的球形結(jié)構(gòu)與Ⅰ型膠原結(jié)合，從而使細(xì)胞與支架黏附得更牢固.

因此本文首先考察了NSCs在經(jīng)過LN修飾的膠原－殼聚糖支架（7∶3）內(nèi)的接種率.由表2可以看出：最初接種的細(xì)胞密度較高，但補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基之后，有一部分細(xì)胞重新從支架上脫離，懸浮于培養(yǎng)基中.在孵育12h后，置換培養(yǎng)器皿時計(jì)數(shù)得到30%～40%的細(xì)胞因?yàn)轲じ讲焕味撀?所以，要保證支架內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)，開始的接種密度一定不能太低（一般高于1×106個／mL）.對比2個實(shí)驗(yàn)組可以看出，LN處理能夠明顯提高NSCs的接種率.

表2 NSCs在膠原－殼聚糖支架（7∶3）內(nèi)的接種率Tab.2 The inoculation rate of NSCs in collagen－chitosan（7∶3）scaffolds

通過Hoechst熒光染色，本文進(jìn)一步考察了NSCs在經(jīng)過LN修飾的膠原－殼聚糖復(fù)合支架（7∶3）中的生長和分布情況.如圖3所示，在經(jīng)LN修飾的支架上，細(xì)胞黏附的數(shù)量明顯多于未經(jīng)過修飾的.因此，經(jīng)過LN修飾后的支架材料大大改善了細(xì)胞在支架上的黏附能力，顯著提高了膠原－殼聚糖支架材料的生物相容性及對細(xì)胞的親合力，對細(xì)胞的黏附行為產(chǎn)生了不可忽視的影響.

圖3 膠原－殼聚糖（7∶3）支架中NSCs的Hoechst熒光染色觀察Fig.3 Hoechst fluorescence staining of NSCs in collagen－chitosan（7∶3）scaffolds

激光共聚焦掃描顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM）是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種高精度分子細(xì)胞生物學(xué)分析儀器，輔以各類免疫熒光探針或熒光染料與被測物質(zhì)特異性結(jié)合，不僅可觀察固定的細(xì)胞組織切片，還可以對活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、分子、離子進(jìn)行實(shí)時動態(tài)觀察和檢測.因此通過Live／Dead Viability－Cytotoxicity Kit染色，應(yīng)用LSCM技術(shù)，實(shí)時檢測了NSCs在經(jīng)過LN修飾的膠原－殼聚糖（7∶3）支架內(nèi)細(xì)胞的死活情況.如圖4所示，培養(yǎng)6d后，活細(xì)胞的比例（圖4（a），69.2%）明顯大于死細(xì)胞的（圖4（b），30.8%）.但由圖4（c）可以看出，單位細(xì)胞數(shù)量多的區(qū)域死細(xì)胞的數(shù)量也相應(yīng)增加（如圖中方框所示，即圖4（a）與圖4（b）疊加后區(qū)域），這可能是由于在一定空間內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量過多，造成營養(yǎng)物質(zhì)缺乏而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡.圖4（d）為 NSCs在Z軸（1.50mm×1.50mm×0.24 mm）上疊加的三維成像照片，表明支架內(nèi)的NSCs培養(yǎng)至第6d時狀態(tài)良好，細(xì)胞仍然保持著旺盛的增殖能力.

圖4 NSCs在經(jīng)過LN修飾的膠原－殼聚糖（7∶3）支架內(nèi) Live／Dead Viability－Cytotoxicity Kit染色Fig.4 Staining of NSCs in LN－treated collagen－chitosan（7∶3）scaffolds by using the Live／Dead Viability－Cytotoxicity Kit

圖5為NSCs在經(jīng)過LN修飾的膠原－殼聚糖（7∶3）支架內(nèi)增殖和分化的掃描電鏡照片.圖5（a）顯示了NSCs以球狀或團(tuán)簇狀黏附于支架的孔壁或孔隙內(nèi)；而圖5（b）則顯示NSCs附著在孔道壁上，分化的神經(jīng)突觸向外伸展，并相互交織呈網(wǎng)狀.這個結(jié)果進(jìn)一步證明了膠原－殼聚糖復(fù)合支架具有良好的生物相容性并提供適合NSCs生長的微環(huán)境，NSCs能夠在支架內(nèi)良好地生長、增殖及分化.

圖5 NSCs在經(jīng)過LN修飾的膠原－殼聚糖（7∶3）支架內(nèi)生長情況的掃描電鏡觀察Fig.5 The growth state of NSCs in LN－treated collagen－chitosan（7∶3）scaffolds via SEM

3 結(jié) 語

三維培養(yǎng)作為體外二維細(xì)胞系統(tǒng)的研究與組織器官及整體研究的橋梁，既能保留體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境的物質(zhì)及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，又能展現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性優(yōu)勢.近幾年來，隨著干細(xì)胞與組織工程技術(shù)的新興發(fā)展，三維培養(yǎng)在組織形成、血管發(fā)育和器官再造等發(fā)育生物學(xué)的分支領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用；同時在篩選新藥的療效分析和毒理實(shí)驗(yàn)方面，利用三維培養(yǎng)獲得了和二維培養(yǎng)方式完全不同的結(jié)果，也引起了藥理學(xué)家的極大興趣［17］.本文采用冷凍干燥法制備了膠原－殼聚糖復(fù)合支架，通過層粘連蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，并測定了其物理性能特征，建立了胎鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）的三維培養(yǎng)體系.通過孔徑、孔隙率、吸水率、降解率等參數(shù)的比較得出，體積比為7∶3的復(fù)合支架更適合于體外細(xì)胞培養(yǎng)的要求；激光共聚焦顯微鏡及掃描電鏡觀察表明，NSCs能夠在膠原－殼聚糖復(fù)合支架內(nèi)良好地生長、增殖及分化.這些結(jié)果對于NSCs的進(jìn)一步臨床移植應(yīng)用，以及治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新藥篩選和機(jī)理研究等有明確的理論和工程實(shí)用意義.然而由于技術(shù)條件的原因，目前體外三維培養(yǎng)所創(chuàng)建的培養(yǎng)條件僅處于亞最佳狀態(tài)，培養(yǎng)的細(xì)胞僅具備有限的生存能力和有限的分化程度，仍然有待于進(jìn)一步發(fā)展和完善.

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