王旭東,姜洪偉,張 偉,王海珠,朱寶平,陳 明,梁國(guó)棟,徐 華

(1.吉林大學(xué)第二臨床醫(yī)院普通外科,吉林長(zhǎng)春130041;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)醫(yī)院腫瘤科;3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

結(jié)直腸癌是我國(guó)較常見(jiàn)的嚴(yán)重危害人民健康的惡性腫瘤之一,世界范圍的流行病學(xué)調(diào)查資料表明,在各類惡性腫瘤中,結(jié)直腸癌的發(fā)病率占第3位,僅次于胃癌和肺癌的第三位惡性腫瘤,結(jié)直腸癌已成為危害人們身體健康的嚴(yán)重疾病。腫瘤發(fā)生、發(fā)展是多基因、多階段的過(guò)程,癌基因的激活與抑癌基因的失活及異常被認(rèn)為是腫瘤的發(fā)生的重要的分子機(jī)制。結(jié)直腸癌治療方式主要是手術(shù)治療,術(shù)前化療,放療可使腫瘤縮小,術(shù)后化療,放療可預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,而化療藥如何使抑癌基因發(fā)揮抑癌效應(yīng)是目前研究熱點(diǎn)[1],本文就常用化療藥(順鉑和5氟尿嘧啶)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW1116DCC基因影響加以闡述。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 SW1116細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海生物研究所。

1.2 主要試劑 TRIzol Reagent(Invitrogen公司)。Taq DNA聚合酶,dNTP,DL2000 DNA Marke,AMV Reverse Transcriptase,Low Protein Marker(均購(gòu)自寶生物工程有限公司)。RNase抑制劑;丙烯酰胺;N,N'-亞甲雙丙烯酰胺;N,N,N,N'-四甲基乙二胺;十二烷基硫酸鈉(SDS);四甲基乙二胺(TEMED)均購(gòu)自Sigma公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞的化療藥處理方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW1116細(xì)胞,計(jì)數(shù),調(diào)細(xì)胞濃度5×105,加入6孔板,分別加入 3.0 μ g/ml的 DDP,260 μ M 的 5-Fu。作用6 h、12 h、24 h后,提取細(xì)胞的mRNA和蛋白備用。

1.3.2 化療藥對(duì)DCC基因的影響 引物的設(shè)計(jì)與合成:嚴(yán)格按照引物設(shè)計(jì)原則。本研究所用引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。上游引物:5′-AAGCTTCCGCCACCATGACAGTCTTGGTTCCGCCATG-3′,下游引物:5′-CTCTCTCTCGAGCTAACTGGAGCTTGGGATAGCAGGC-3′。

我們采用RT-PCR法研究常用化療藥對(duì)DCC基因轉(zhuǎn)錄的影響,采用Western-Blot法化療藥對(duì)DCC蛋白表達(dá)的影響。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR法檢測(cè) DDP、5-Fu處理的SW1116中DCC基因的轉(zhuǎn)錄影響見(jiàn)圖1。從圖1可以看出,以RT-PCR法雜交出的特異性條帶的灰度值高低來(lái)判斷不同化療藥物作用不同時(shí)間對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW1116中DCC基因轉(zhuǎn)錄的影響。順鉑和5-氟尿嘧啶可以促進(jìn)DCC基因轉(zhuǎn)錄的表達(dá),6小時(shí)開(kāi)始上升,12小時(shí)表達(dá)量最高,隨著時(shí)間的增加,DCC基因的轉(zhuǎn)錄開(kāi)始下降,細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減慢,24小時(shí)達(dá)低值。

圖1 RT-PCR法檢測(cè) DDP、5-Fu處理的SW1116中DCC基因的轉(zhuǎn)錄

2.2 DDP、5-Fu處理的SW1116中DCC基因的蛋白影響 見(jiàn)圖2。從圖2可以看出:western blot雜交出的特異性條帶的灰度值高低來(lái)判斷不同化療藥物作用不同時(shí)間對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW1116中DCC蛋白表達(dá)的影響。順鉑和5-氟尿嘧啶作用結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW1116,可以促進(jìn)DCC蛋白的表達(dá),并且在6小時(shí)DCC蛋白表達(dá)開(kāi)始上升,12小時(shí)更加明顯,表達(dá)量最高,細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減慢,24小時(shí)達(dá)低值。結(jié)果表明DCC基因表達(dá)水平降低或缺失在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能起了重要的作用,尤其對(duì)大腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)過(guò)程的影響更為明顯,說(shuō)明常用化療藥物可通過(guò)使癌細(xì)胞表達(dá)DCC量的上升來(lái)實(shí)現(xiàn)其抗癌作用。

圖2 Western-Blot法檢測(cè)DDP、5-Fu處理的SW1116中DCC基因的蛋白表達(dá)

3 討論

DCC基因定位于人染色體18q21.3,全長(zhǎng)300-400 kb,至少含有28個(gè)外顯子,cDNA長(zhǎng)約4 341 bp。Cho等從基因庫(kù)里分離出含所有已知編碼序列的噬菌體,克隆其完整全長(zhǎng)1.4 Mb,確定了第29號(hào)外顯子的存在,并確定了每個(gè)內(nèi)外顯子的邊界序列。DCC基因的表達(dá)蛋白是Ⅰ型跨膜糖蛋白,由1447個(gè)氨基酸組成,相對(duì)分子質(zhì)量為190 KD,該蛋白主要包括3個(gè)功能區(qū),即胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū),該膜糖蛋白在許多研究中被指出與細(xì)胞分化有關(guān)。該基因?yàn)槟[瘤抑制基因[2]。該基因的最重要的功能已經(jīng)在神經(jīng)系統(tǒng)中被描述為netrin-1的受體。結(jié)腸癌缺失基因敲出的小鼠證實(shí)了這個(gè)基因在腫瘤轉(zhuǎn)移方面的一個(gè)很重要的角色,然而質(zhì)疑了該基因在腫瘤抑制的意義和作為黏液受體方面的不同。結(jié)腸癌缺失基因轉(zhuǎn)染HT-29人結(jié)腸細(xì)胞會(huì)增加細(xì)胞之間的黏附性,損害細(xì)胞之間的物質(zhì)交換,細(xì)胞和細(xì)胞之間以及細(xì)胞和基質(zhì)之間黏附結(jié)構(gòu)在不同組織之間細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)的保持和發(fā)展有關(guān)的遷移起著重要作用,以及組織重構(gòu)和病理狀態(tài),連接復(fù)合體連接著細(xì)胞外基質(zhì)的配體和鄰近細(xì)胞為骨架提供細(xì)胞表面的化學(xué)信號(hào)提供分子支持。在人體上,細(xì)胞外骨架蛋白細(xì)胞外基質(zhì)和鄰近細(xì)胞連接起來(lái),特別是在信號(hào)傳導(dǎo)中。一個(gè)大的黏附蛋白家族包含著免疫球蛋白,以各種各樣的免疫球蛋白和纖維蛋白III的出現(xiàn)為特征。發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的軸突導(dǎo)向有關(guān),并且是細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)因子之一。這些基因編碼細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)換子,作用于TGF-β配體家族成員的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[3]。

5-FU對(duì)腫瘤殺傷作用的強(qiáng)弱,直接與抑制胸苷酸合成酶的程度有關(guān),亦即決定于三元復(fù)合物的穩(wěn)定性。順鉑的活性受溶液中的氯離子的影響極大,在生理鹽水中其活性在24小時(shí)以上是穩(wěn)定的,但是在不含氯離子的溶液中,其活性每小時(shí)減少10%[4]。順鉑在體液條件下,由于體液的氯離子濃度高,它大部分以原型化合物的形式存在,但是當(dāng)其進(jìn)入低氯離子濃度的細(xì)胞內(nèi),其氯基被代謝。代謝產(chǎn)物荷正電,它具有類似于烷化劑雙功能基團(tuán)的作用,與細(xì)胞內(nèi)的親核基團(tuán)結(jié)合,主要與DNA鏈上的堿基作用,與堿基結(jié)合形成三種形式的交聯(lián),改變其作為正常復(fù)制模板的功能,造成DNA的損傷,破壞DNA的復(fù)制,誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡,阻斷細(xì)胞周期的G2期,它還可以間接促進(jìn)機(jī)體免疫而產(chǎn)生細(xì)胞毒作用[5]。

本實(shí)驗(yàn)研究表明:采用RT-PCR法和western blot法雜交出的特異性條帶的灰度值高低來(lái)判斷不同化療藥物作用不同時(shí)間對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW1116中DCC基因的影響。從基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平觀察:順鉑和 5-氟尿嘧啶作用結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW1116,可以促進(jìn)DCC基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá),并且在6小時(shí)DCC蛋白開(kāi)始上調(diào),12小時(shí)更加明顯,表達(dá)量最高,細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減慢,24小時(shí)達(dá)低值。結(jié)果表明DCC基因表達(dá)水平降低或缺失在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能起了重要的作用,尤其對(duì)大腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)過(guò)程的影響更為明顯,說(shuō)明常用化療藥物可通過(guò)使癌細(xì)胞表達(dá)DCC量的上升來(lái)實(shí)現(xiàn)其抗癌作用。成為大腸癌基因治療的一個(gè)有效靶基因。

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