李宏偉,周 波,文 敏,焦 玲,張春林

(貴陽醫(yī)學(xué)院 1.人體解剖學(xué)教研室;2.附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;3.生物學(xué)教研室,貴州 貴陽550004)

帕金森病(Parkinson's disease)是最為常見的神經(jīng)退行性疾病,在65歲以上人群發(fā)病率約為1-3%,僅次于阿爾茨海默病[1,2]。其主要的神經(jīng)病理學(xué)特征是黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元進行性退化以及胞漿內(nèi)路易小體(Lewy body)形成[3,4]。路易小體的主要成分是大量聚集的α-突觸核蛋白(α-synuclein),α-突觸核蛋白的過表達與PD發(fā)病密切相關(guān)[5]。本實驗運用慢性百草枯聯(lián)合代森錳暴露小鼠建立PD模型,通過檢測小鼠運動活性、黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(Tyrosine Hydroxylase,TH)陽性神經(jīng)元數(shù)量和α-synuclein的表達水平,探討百草枯聯(lián)合代森錳致帕金森病的可靠性。

1 材料與方法

1.1 模型建立與分組

健康雄性C57BL/6小鼠30只,鼠齡7周,體重24-26克,由重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司提供。小鼠飼養(yǎng)于貴陽醫(yī)學(xué)院動物實驗中心,室溫維持在18±2℃,濕度維持在50±10%,12/12光暗周期,自由進食和飲水。實驗開始前先給予適應(yīng)環(huán)境一周。小鼠隨機分為正常對照組(10只)和、PQ+Mn染毒組(20只)。模型組給予百草枯(PQ,praquat,1,1'-dimethyl-4,4'bipyridinium,10mg/kg,Sigma公司)和代森錳(Mn,maneb,30 mg/kg,Sigma公司),溶于生理鹽水后腹腔注射,每周二、四早上各一次,連續(xù)6周;對照組在同一時間給予同等劑量的生理鹽水。

1.2 爬桿實驗

爬桿實驗用于檢測小鼠肢體運動協(xié)調(diào)性,以判斷小鼠運動行為異常的程度,于最后一次給藥后的第7天測試。測試方法如下:自制直徑為1 cm,高60 cm的直木桿,桿頂部有一橡膠球,木桿固定于木制底座上。木桿纏上紗布以防打滑。將小鼠頭向下放置,后爪抓住橡膠球,記錄動物從開始向下爬到前爪著地所用的時間,如遇小鼠中途停頓或轉(zhuǎn)身向上爬,則重新檢測,每只在記錄前訓(xùn)練3次,訓(xùn)練完畢后對其進行爬桿時間測定[6,7]。

1.3 標(biāo)本采集

用3.6%的水合氯醛(1 ml/100 g體重)麻醉動物,在其左胸前壁縱行剪開心包,充分暴露心臟,經(jīng)心包橫竇引過一絲線,繞主動脈及肺動脈根部打一松結(jié),剪開左心室,將套管插入升主動脈中,結(jié)扎固定套管并立即開始灌注。先用生理鹽水50 ml(37℃)沖去血液,流速宜大,至右心室流出液體無色或略帶紅色,即可終止灌洗而改用固定液(4%多聚甲醛、飽和苦味酸、戊二醛)灌注,時間約30 min。灌注后開顱取腦,放入后固定液(4%多聚甲醛)中固定24小時。經(jīng)脫水、常規(guī)石蠟包埋、冠狀連續(xù)切片,切片厚6 μ m,隔6取2,用于免疫組織化學(xué)染色。

1.4 TH和α-synuclein免疫組化(SABC法)

按試劑盒說明書操作。結(jié)果判定:以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性神經(jīng)元。

1.5 圖像分析

每只小鼠隨機選取5張切片,每張切片隨機選取4個視野,在同一視場面積,同一放大倍數(shù),同一背景光強度下采集圖像,運用美國Mc公司Image-Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計TH陽性神經(jīng)元數(shù)量以及測定α-synuclein陽性反應(yīng)物積分光密度值。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 爬桿實驗

爬桿實驗檢測顯示,PQ聯(lián)合Mn腹腔注射后,小鼠爬桿時間較正常對照組顯著延長(P＜0.05),見圖1,并出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)下桿或因喪失握持能力直接從桿上滑下,無法爬桿的現(xiàn)象。

圖1 小鼠爬桿時間比較

2.2 TH免疫組織化學(xué)染色

TH免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示(圖2):正常對照組小鼠在中腦腹側(cè)黑質(zhì)致密部和腹側(cè)被蓋區(qū)可見許多TH陽性神經(jīng)元(107.83±7.885),細胞多為錐體形和三角形,胞漿內(nèi)棕色顆粒濃;模型組小鼠黑質(zhì)致密部和腹側(cè)被蓋區(qū)TH陽性細胞顯著減少(36.17±4.082),較正常組減少約66.5%,胞漿內(nèi)染色較為淺淡。

圖2 小鼠黑質(zhì)TH免疫組織化學(xué)染色(SABC法,×100)

2.3 α-synuclein免疫組織化學(xué)染色

α-synuclein免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示(圖3):與正常對照組相比,模型組小鼠黑質(zhì)致密部α-synuclein積分光密度顯著增高(P＜0.05),表達水平明顯升高,但在胞漿中沒有觀察到路易小體。

圖3 小鼠黑質(zhì)α-synuclein免疫組織化學(xué)染色(SABC法,×400)

3 討論

PD動物模型的建立對闡明其發(fā)病機制,發(fā)現(xiàn)藥物作用靶點,新藥研發(fā)與篩選,以及新藥評價與用藥方案的確定具有重要意義。目前,常用的PD神經(jīng)毒素模型包括 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)、魚藤酮、6-羥多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)等,這些模型雖能模擬出PD的臨床癥狀與病理改變,但多為非自然產(chǎn)生的神經(jīng)毒素,與我國患者實際病因不符。PQ是世界上最為常用的除草劑之一,由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)與MPTP的活性物質(zhì)MPP+極為相似,可引起人類及動物產(chǎn)生帕金森病,自2007年起已經(jīng)被美國等13個國家禁用,但在我國仍廣泛使用[8,9]。Mn是一種除真菌劑,與PQ的使用存在地域上的重疊,能夠加劇多巴胺神經(jīng)元的丟失和運動障礙[10,11]。因此,聯(lián)合PQ與Mn建立小鼠PD模型,既符合我國國情,又符合PD多環(huán)境因素致病的學(xué)說。

本實驗研究結(jié)果顯示,慢性暴露于百草枯和代森錳,使C57BL/6小鼠的運動能力減弱,黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量顯著降低,α-synuclein過度表達,這與 Chen等在其它動物模型研究結(jié)果一致[12,13]。α-synuclein過度表達可能是引起多巴胺神經(jīng)元死亡的主要原因:(1)α-synuclein過表達導(dǎo)致活性氧(ROS)的增加,通過脂質(zhì)過氧化、DNA損傷,抑制線粒體呼吸鏈的活性,引起細胞死亡[14,15]。(2)αsynuclein過表達能激活小膠質(zhì)細胞和產(chǎn)生硝化應(yīng)激,引起細胞死亡[16,17]?？梢?增強對α-synuclein的清除將成為帕金森病治療的新策略。

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