法夫酵母產(chǎn)蝦青素的反復(fù)分批及反復(fù)分批補(bǔ)料發(fā)酵

肖安風(fēng)，倪輝，李利君，蔡慧農(nóng)

1 集美大學(xué)生物工程學(xué)院，廈門 361021

2 廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，廈門 361021

法夫酵母產(chǎn)蝦青素的反復(fù)分批及反復(fù)分批補(bǔ)料發(fā)酵

肖安風(fēng)1,2，倪輝1,2，李利君1,2，蔡慧農(nóng)1,2

1 集美大學(xué)生物工程學(xué)院，廈門 361021

2 廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，廈門 361021

以生物量和蝦青素產(chǎn)量為指標(biāo)，考察法夫酵母多批次半連續(xù)培養(yǎng)產(chǎn)蝦青素的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在搖瓶上分別以4 d和5 d為周期反復(fù)分批培養(yǎng)法夫酵母，蝦青素產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加再下降的趨勢(shì)，但第2代至第7代蝦青素產(chǎn)量仍高于第1代，并且4 d為周期的蝦青素平均產(chǎn)量略高于5 d的。在5 L罐法夫酵母進(jìn)行反復(fù)分批補(bǔ)料發(fā)酵中，不管是補(bǔ)加30%的葡萄糖還是補(bǔ)加30%的淀粉水解糖，第2個(gè)批次發(fā)酵的生物量和蝦青素產(chǎn)量均達(dá)到第1個(gè)批次的水平，表明菌種穩(wěn)定性較好。

蝦青素，法夫酵母，反復(fù)分批發(fā)酵，反復(fù)分批補(bǔ)料發(fā)酵，穩(wěn)定性

Abstract:A comparative study of batch and repeated batch process was carried out for astaxanthin fermentation of Phaffia rhodozyma to develop a more economical method for astaxanthin industrial production. In shaking flask fermentation, the change of biomass and astaxanthin production was studied to compare the five-day cycle with four-day cycle of repeated batch culture of P. rhodozyma. Astaxanthin production increased at first and then decreased subsequently in seven cycles, yet the yield of astaxanthin in the next six cycles remains higher than that of the first cycle. Comparing the average production of astaxanthin in the seven cycles, four-day cycle performed even better than five-day cycle. Subsequently, a repeated fed-batch process was used in a 5-l bioreactor. The experimental data showed that biomass and astaxanthin production of the second batch could reach the level of the first batch, no matter that the carbon source was glucose or hydrolysis sugar of starch. This result showed that this strain had good stability, and thus repeated batch and fed-batch process could be applied in astaxanthin fermentation for economical purpose.

Keywords:astaxanthin, Phaffia rhodozyma, repeated batch, repeated fed-batch, stability

蝦青素是一種非維生素A原的類胡蘿卜素，具有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、提高免疫力等多種生物學(xué)功能，在飼料、食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)中具有廣泛的需求，其市場(chǎng)非常廣闊[1]。

作為蝦青素的生產(chǎn)菌，法夫酵母 Phaffia rhodozyma相比雨生紅球藻Haematococcus pluvialis具有許多優(yōu)勢(shì)：可利用多種糖進(jìn)行快速異養(yǎng)代謝、培養(yǎng)時(shí)間短、菌體可綜合利用、發(fā)酵過(guò)程易于產(chǎn)業(yè)化等[2-3]。因此，人們以法夫酵母為研究對(duì)象，對(duì)菌種選育、發(fā)酵技術(shù)等方面進(jìn)行了深入、系統(tǒng)的研究，并獲得了一定的成果。如 Sun等[4]采用 γ射線誘變法夫酵母，Lewis等[5]采用NTG誘變和紫羅蘭酮篩選突變株，法夫酵母的類胡蘿卜素含量均有顯著提高，Chun等[6]利用誘變得到的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株作為親本進(jìn)行原生質(zhì)體融合，得到類胡蘿卜素含量提高近 4倍的高產(chǎn)菌株。對(duì)于法夫酵母發(fā)酵，培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件是關(guān)鍵因素，培養(yǎng)溫度、pH和溶氧條件[7]、C/N比[8]、碳源組成[9]、氮源組成[10]等均對(duì)法夫酵母發(fā)酵蝦青素的產(chǎn)量或生產(chǎn)成本有影響：Ramirez等[11]采用最陡爬坡法和響應(yīng)面分析，優(yōu)化pH、溫度、接種量、碳源濃度和氮源濃度5個(gè)因素，蝦青素的最高產(chǎn)量可達(dá)8.1 mg/L，較優(yōu)化前提高了92%；為了降低發(fā)酵成本，Haard[12]采用廉價(jià)的糖蜜作為發(fā)酵底物，蝦青素的產(chǎn)量比用葡萄糖為底物提高 3倍。采用添加前體或促進(jìn)劑的方式，也可以提高蝦青素的產(chǎn)量：Calo等[13]在培養(yǎng)基中添加 1 g/L的甲羥戊酸，結(jié)果蝦青素和總類胡蘿卜素產(chǎn)量提高了300%以上；F1ores-Cotera等[14]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加檸檬酸可以顯著提高蝦青素的產(chǎn)量和含量。

在微生物培養(yǎng)過(guò)程中，采用反復(fù)分批發(fā)酵工藝，由于只需 1次菌種活化及種子培養(yǎng)，就可以進(jìn)行多個(gè)批次的發(fā)酵，大大縮短了發(fā)酵時(shí)間，可以有效地提高生產(chǎn)率，因此，這種工藝在許多工業(yè)發(fā)酵過(guò)程中都得到了應(yīng)用[15-17]。目前，人們對(duì)法夫酵母產(chǎn)蝦青素的發(fā)酵工藝已經(jīng)做了很多有效的工作，并開(kāi)發(fā)出了適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵工藝。不過(guò)，由于前期的菌種活化、種子擴(kuò)大培養(yǎng)需要較長(zhǎng)的時(shí)間，無(wú)形中使發(fā)酵周期加長(zhǎng)，生產(chǎn)效率也因之下降。本實(shí)驗(yàn)分別在搖瓶和5 L罐上，對(duì)比研究分批發(fā)酵和反復(fù)分批發(fā)酵兩種工藝培養(yǎng)法夫酵母蝦青素的差異，考察反復(fù)分批發(fā)酵工藝應(yīng)用到法夫酵母蝦青素生產(chǎn)的可行性，以期實(shí)現(xiàn)提高生產(chǎn)效率，開(kāi)發(fā)出一種經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的蝦青素發(fā)酵工藝。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

法夫酵母Pst-1菌株，由柏林工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)系Ulf Stahl教授饋贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室保存。

斜面菌種培養(yǎng)基[18]：葡萄糖10 g/L，細(xì)菌蛋白胨 3 g/L，麥汁3 g/L，酵母膏3 g/L，瓊脂20 g/L。

種子培養(yǎng)基[19]：葡萄糖 20 g/L，(NH4)2SO45 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl2·H2O 0.1 g/L，酵母膏3 g/L，pH 6.0。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基[19]：葡萄糖35 g/L，(NH4)2SO45 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl2·H2O 0.1 g/L，酵母膏 3 g/L，pH 6.0。

補(bǔ)料培養(yǎng)基：30%的葡萄糖或淀粉水解糖液。

1.2 種子擴(kuò)大培養(yǎng)及發(fā)酵

1.2.1 菌種制備

將斜面活化的菌種接種至裝有含30 mL發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，22 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)4 d，取1 mL一代種子接種于裝液量30 mL的250 mL搖瓶中，22 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)2 d[20]。

1.2.2 搖瓶反復(fù)分批發(fā)酵

將二級(jí)種子液以適當(dāng)?shù)慕臃N量 (10%) 接入裝有含30 mL發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，22 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)一段時(shí)間后，以搖瓶發(fā)酵液作為種子，按10%的接種量接入另一裝有含30 mL發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，如此反復(fù)進(jìn)行發(fā)酵。

1.2.3 5 L罐反復(fù)分批補(bǔ)料發(fā)酵

將培養(yǎng)好的搖瓶種子接入裝4 L發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的發(fā)酵罐 (美國(guó)NBS公司，BioFlo 110型) 內(nèi)，22 ℃、pH 4.0、溶氧40%下進(jìn)行發(fā)酵。在發(fā)酵過(guò)程中，每隔4小時(shí)用3,5-二硝基水楊酸法 (DNS法) 檢測(cè)發(fā)酵液中還原糖濃度，通過(guò)調(diào)節(jié)補(bǔ)料培養(yǎng)基補(bǔ)加速率，控制糖濃度在15~25 g/L 左右。每隔8小時(shí)取樣檢測(cè)生物量，當(dāng)生物量在24 h內(nèi)不再增加時(shí)，此時(shí)生物量已達(dá)到峰值，放罐，留部分發(fā)酵液，按10%接種量 (約400 mL) 接入新鮮4 L的培養(yǎng)基，反復(fù)進(jìn)行發(fā)酵。

1.3 分析方法

1.3.1 發(fā)酵液糖濃度測(cè)定

采用 DNS法[21]：取發(fā)酵液 3 500 r/min離心5 min，將上清稀釋一定倍數(shù)后取1 mL，與3 mL DNS試劑混合，沸水浴反應(yīng)15 min，冷卻后蒸餾水定容至25 mL，在520 nm處測(cè)吸光度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算即可得到發(fā)酵液的糖濃度。

1.3.2 生物量測(cè)定

取5 mL菌液3 500 r/min離心5 min后去上清，蒸餾水洗滌菌體，離心去上清，105 ℃下烘至恒重。

1.3.3 蝦青素的提取及測(cè)定

取1 mL發(fā)酵液樣品3 500 r/min離心5 min，去上清，用蒸餾水洗滌沉淀，菌體加入 2 mL預(yù)熱至75 ℃的DMSO，立即劇烈振蕩，50 ℃破壁5 min，再加入5 mL的無(wú)水乙醇，振蕩搖勻，3 500 r/min離心5 min，將上清用無(wú)水乙醇定容至10 mL，用紫外分光光度計(jì)在474 nm下測(cè)定吸光值[22]。

1.3.4 二次參數(shù)計(jì)算

根據(jù)得到的生物量濃度、蝦青素濃度及發(fā)酵液的糖濃度，計(jì)算蝦青素單產(chǎn)、細(xì)胞得率和蝦青素得率，計(jì)算公式如下：

蝦青素單產(chǎn)=蝦青素濃度/生物量濃度 (mg蝦青素/g干細(xì)胞)；

細(xì)胞得率=生物量濃度/消耗的糖濃度 (g干細(xì)胞/g 糖)；

蝦青素得率=蝦青素濃度/消耗的糖濃度 (mg蝦青素/g糖)。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶反復(fù)分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本菌種在搖瓶培養(yǎng)的第 4天進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)發(fā)酵液中的生物量和蝦青素濃度接近或達(dá)到最大值，此后 2 d內(nèi)生物量和蝦青素含量基本不變，因此，在搖瓶上，選擇4 d和5 d周期進(jìn)行反復(fù)分批發(fā)酵，分別在每個(gè)周期結(jié)束時(shí)取樣檢測(cè)生物量、蝦青素濃度和糖濃度，并計(jì)算每個(gè)周期的蝦青素單產(chǎn)、細(xì)胞得率和蝦青素得率。

圖1是以4 d和5 d為周期的反復(fù)分批發(fā)酵，其傳代次數(shù)和法夫酵母生物量及蝦青素產(chǎn)量變化的關(guān)系圖。以4 d為周期進(jìn)行反復(fù)分批發(fā)酵，前3個(gè)批次的生物量比較接近，在4 g/L左右，4~7代生物量有所增加，在6 g/L的范圍；而以5 d為周期進(jìn)行反復(fù)分批發(fā)酵，前 4個(gè)批次呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，第 4~7個(gè)批次，生物量也基本穩(wěn)定在6 g/L左右。從蝦青素產(chǎn)量變化來(lái)看，4 d為周期反復(fù)分批發(fā)酵的蝦青素產(chǎn)量，在第2個(gè)批次達(dá)到最高值3.59 mg/L，從第 2個(gè)批次開(kāi)始呈遞減的趨勢(shì)，至第 7批次降至1.99 mg/L，與第1個(gè)批次1.95 mg/L基本相等；5 d為周期發(fā)酵的蝦青素產(chǎn)量，前2個(gè)批次蝦青素含量約為2 mg/L，第3批次略有下降，為1.77 mg/L，第4批次增至3.17 mg/L，然后呈遞減趨勢(shì)，至第7代減至2.13 mg/L。

從單產(chǎn)來(lái)看，4 d為1周期的蝦青素單產(chǎn)，其數(shù)值先呈增加趨勢(shì)，第2和第3批次分別達(dá)到0.96 mg蝦青素/g干細(xì)胞和0.90 mg蝦青素/g干細(xì)胞，隨后單產(chǎn)開(kāi)始遞減，其中第4、第5批次單產(chǎn)略高于第1批次，而第6、第7批次略低于第1批次；5 d為一周期的單產(chǎn)最大在第 1批次，蝦青素單產(chǎn)達(dá)到1.25 mg蝦青素/g干細(xì)胞，第2~6批次穩(wěn)定在0.5 mg蝦青素/g干細(xì)胞左右。比較可知，5 d為周期的單產(chǎn)總體上高于4 d周期的單產(chǎn)。

圖1 不同周期搖瓶反復(fù)分批發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Fig. 1 Change of cell growth and astaxanthin formation in repeated batch culture of P. rhodozyma in shaking flask fermentation.

比較兩種周期反復(fù)分批發(fā)酵的蝦青素平均產(chǎn)量，以4 d為周期進(jìn)行反復(fù)分批發(fā)酵，蝦青素平均產(chǎn)量為2.70 mg/L，5 d周期的蝦青素平均產(chǎn)量為2.35 mg/L，前者略高于后者，此外，4 d周期所需發(fā)酵時(shí)間更短，因此，在搖瓶上進(jìn)行 4 d周期的反復(fù)分批發(fā)酵，要優(yōu)于5 d周期的反復(fù)分批發(fā)酵。

由此可見(jiàn)，在一定批次內(nèi)進(jìn)行搖瓶反復(fù)分批發(fā)酵，對(duì)法夫酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和蝦青素生產(chǎn)有利。這說(shuō)明本菌株生產(chǎn)蝦青素的性能比較穩(wěn)定，不會(huì)出現(xiàn)因傳代次數(shù)多而導(dǎo)致菌株退化、產(chǎn)物產(chǎn)量下降的情況。

2.2 罐上反復(fù)分批補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 補(bǔ)葡萄糖對(duì)法夫酵母產(chǎn)蝦青素的影響

在5 L罐中，以葡萄糖作為碳源，進(jìn)行兩個(gè)批次的反復(fù)分批補(bǔ)料發(fā)酵，取樣檢測(cè)發(fā)酵過(guò)程生物量、蝦青素濃度和葡萄糖濃度，根據(jù)生物量、蝦青素濃度和葡萄糖消耗量變化，進(jìn)行單產(chǎn)、細(xì)胞得率和蝦青素得率的計(jì)算，所得結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以得出，在反復(fù)分批補(bǔ)料過(guò)程中，兩個(gè)批次的生物量變化曲線基本一致，在發(fā)酵過(guò)程呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)，在批次發(fā)酵的后期，生物量均達(dá)到最大值，分別為47.0 g/L (第1批次) 和49.5 g/L(第2批次)。在每個(gè)批次發(fā)酵的前26 h，葡萄糖消耗量近似為 0，隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行，每個(gè)批次的葡萄糖消耗量均不斷增加，但第2個(gè)批次的糖耗要稍少于第 1個(gè)批次的糖耗。每個(gè)批次蝦青素濃度隨時(shí)間呈遞增的現(xiàn)象，第 1個(gè)批次蝦青素濃度最大值為18.96 mg/L，而第 2個(gè)批次蝦青素濃度最大值為23.14 mg/L，在獲得相等的生物量的情況下，第 2個(gè)批次發(fā)酵所獲得的蝦青素要高于第1個(gè)批次。

圖 2 以葡萄糖作為碳源進(jìn)行罐上反復(fù)分批補(bǔ)料發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Fig. 2 Profiles of cell growth, astaxanthin formation and quandratic parameters in repeated fed-batch with 30% glucose in 5-l bioreactor. ▲: dry cell weight; ●: astaxanthin concentration; +: consumed glucose; ?: yield of astaxanthin on biomass; ○: yield of astaxanthin on consumed glucose; ×: yield of biomass on consumed glucose.

對(duì)二次參數(shù)的變化情況進(jìn)行分析，可以看出，第1批次蝦青素單產(chǎn)在18 h時(shí)為0.74 mg蝦青素/g干細(xì)胞，隨后穩(wěn)定0.3~0.60 mg蝦青素/g干細(xì)胞之間，第 2個(gè)批次蝦青素單產(chǎn)沒(méi)有出現(xiàn)突然增大的情況，前50 h逐漸增大，最后穩(wěn)定在0.4~0.6 mg蝦青素/g干細(xì)胞之間，第 2批次發(fā)酵中后期蝦青素單產(chǎn)要略高于第1批次。

兩個(gè)批次細(xì)胞得率變化有所不同，第 1個(gè)批次細(xì)胞得率變化比較穩(wěn)定，前期在0.25 g干細(xì)胞/g糖左右變化，然后細(xì)胞得率呈緩慢下降趨勢(shì)，最終降至0.12 g干細(xì)胞/g糖。第2個(gè)批次細(xì)胞得率由0.23 g干細(xì)胞/g糖突然升至最大值1.52 g干細(xì)胞/g糖，然后在40 h內(nèi)迅速降至0.21 g干細(xì)胞/g糖，后期細(xì)胞得率下降緩慢，最終為0.14 g干細(xì)胞/g糖。

比較兩個(gè)批次的蝦青素得率變化，蝦青素得率前期均迅速增加，達(dá)到最大值，然后出現(xiàn)連續(xù)下降。雖然第1個(gè)批次蝦青素得率最大值 (0.23 mg蝦青素/g糖) 大于第2個(gè)批次 (0.18 mg蝦青素/g糖)，但第1個(gè)批次蝦青素得率下降速率比第2個(gè)批次快，因此在發(fā)酵中后期，第2個(gè)批次的蝦青素得率明顯高于第1個(gè)批次。

對(duì)圖 2的發(fā)酵參數(shù)變化進(jìn)行總體分析，可以發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)批次的生物量、蝦青素含量、蝦青素單產(chǎn)、細(xì)胞得率、蝦青素得率均有類似的變化趨勢(shì)，而且第 2個(gè)批次所獲得的生物量和蝦青素并未降低，這說(shuō)明以葡萄糖作為碳源，進(jìn)行法夫酵母產(chǎn)蝦青素的反復(fù)分批補(bǔ)料發(fā)酵是可行的。

2.2.2 補(bǔ)水解糖對(duì)法夫酵母產(chǎn)蝦青素的影響

由于法夫酵母發(fā)酵過(guò)程需要消耗大量的葡萄糖，為了降低成本，可以用主要成分為葡萄糖的淀粉水解糖代替葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵。在本試驗(yàn)中，用淀粉水解糖代替葡萄糖作為碳源，在5 L罐中進(jìn)行反復(fù)分批補(bǔ)料發(fā)酵，取樣檢測(cè)生物量、蝦青素濃度和殘?zhí)?，并?jì)算二次參數(shù)變化，結(jié)果如圖3所示。

從圖 3可以得出，以淀粉水解糖作為碳源進(jìn)行反復(fù)分批補(bǔ)料發(fā)酵，兩個(gè)批次的生物量變化曲線基本一致，在發(fā)酵過(guò)程呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)，在批次發(fā)酵的后期，生物量均達(dá)到最大值，分別為27.2 g/L(第1批次) 和29.5 g/L (第2批次)。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，不斷消耗淀粉水解糖，其中第 2個(gè)批次達(dá)到較大生物量所需要的水解糖量略少于第1個(gè)批次。第1個(gè)批次蝦青素濃度呈現(xiàn)持續(xù)增長(zhǎng)的情況，甚至在發(fā)酵后期，生物量不再增加時(shí)，蝦青素濃度還有較大增長(zhǎng)，最終達(dá)到17.34 mg/L；第2個(gè)批次蝦青素濃度變化與細(xì)胞生長(zhǎng)呈正相關(guān)的關(guān)系，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯時(shí)，蝦青素濃度穩(wěn)定在13 mg/L的范圍，后期細(xì)胞出現(xiàn)衰亡，蝦青素濃度也下降。可以發(fā)現(xiàn)，第2個(gè)批次蝦青素含量的增長(zhǎng)速率明顯高于第 1個(gè)批次，除去最終階段的兩個(gè)點(diǎn)，蝦青素含量第2個(gè)批次高于第1個(gè)批次。

圖 3 以淀粉水解糖作為碳源進(jìn)行罐上反復(fù)分批補(bǔ)料發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Fig. 3 Profiles of cell growth, astaxanthin formation and quandratic parameters in repeated fed-batch with 30%hydrolysis sugar of starch in 5-l bioreactor. ▲: dry cell weight;●: astaxanthin concentration; +: consumed sugar; ?: yield of astaxanthin on biomass; ○: yield of astaxanthin on consumed sugar; ×: yield of biomass on consumed sugar.

對(duì)二次參數(shù)的變化情況進(jìn)行分析，第 1批次在8 h時(shí)為1.57 mg蝦青素/g干細(xì)胞，隨后降至0.3 mg蝦青素/g干細(xì)胞左右 (16~56 h)，64 h后穩(wěn)定在0.6 mg蝦青素/g干細(xì)胞之間，第2批次自136 h開(kāi)始，蝦青素單產(chǎn)沒(méi)有出現(xiàn)突然增大的情況，而是出現(xiàn)逐步上升的趨勢(shì)，至244 h達(dá)到最大值0.57 mg蝦青素/g干細(xì)胞。比較兩個(gè)批次的蝦青素單產(chǎn)，在發(fā)酵中后期兩個(gè)批次差別不大。

兩個(gè)批次細(xì)胞得率變化均出現(xiàn)先增加再下降的情況，其中第 1個(gè)批次細(xì)胞得率變化比較穩(wěn)定，細(xì)胞得率在16 h達(dá)到最大值0.33 g干細(xì)胞/g糖，然后呈緩慢下降趨勢(shì)，最終降至0.12 g干細(xì)胞/g糖。從136 h至172 h，第2個(gè)批次的細(xì)胞得率出現(xiàn)一較快增長(zhǎng)，172 h達(dá)到最大值1.30 g干細(xì)胞/g糖，然后緩慢下降，發(fā)酵結(jié)束時(shí)降至0.06 g干細(xì)胞/g糖。

第 1個(gè)批次蝦青素得率變化出現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)，整個(gè)變化過(guò)程比較平穩(wěn)，64 h時(shí)達(dá)到最大值0.11 mg 蝦青素/g糖。第2個(gè)批次，蝦青素得率先快速增加，至172 h達(dá)到0.51 mg蝦青素/g糖，然后迅速降至0.1 mg蝦青素/g糖左右，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)蝦青素得率最低，為0.04 mg蝦青素/g糖。

對(duì)圖3的發(fā)酵參數(shù)變化進(jìn)行總體分析，第1和第 2個(gè)批次的生物量、蝦青素含量、蝦青素單產(chǎn)、細(xì)胞得率、蝦青素得率變化趨勢(shì)基本一致。相對(duì)于第1個(gè)批次，第2個(gè)批次所獲得的生物量和蝦青素并未降低，說(shuō)明以淀粉水解糖作為碳源，進(jìn)行連續(xù)兩個(gè)批次的法夫酵母產(chǎn)蝦青素的反復(fù)分批補(bǔ)料發(fā)酵，不會(huì)出現(xiàn)因菌種退化而導(dǎo)致產(chǎn)量下降的情況。

3 討論

工業(yè)發(fā)酵過(guò)程廣泛采用分批和分批補(bǔ)料發(fā)酵工藝，但是，每個(gè)發(fā)酵批次均要花費(fèi)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間制備種子，同時(shí)每次均要對(duì)所涉及的發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行滅菌，過(guò)程繁瑣且費(fèi)時(shí)[23]。采用反復(fù)分批發(fā)酵工藝，只需要進(jìn)行一次菌種活化及種子培養(yǎng)，就可以進(jìn)行多個(gè)批次的發(fā)酵，因而大大地縮短了發(fā)酵時(shí)間，可以有效地提高生產(chǎn)率，在工業(yè)發(fā)酵過(guò)程中有很好的應(yīng)用前景。

一般來(lái)說(shuō)，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的微生物活力最高，此時(shí)最適宜作為種子接入進(jìn)行發(fā)酵，因此，當(dāng)部分發(fā)酵液取出作為種子接入發(fā)酵罐后，原來(lái)的發(fā)酵罐會(huì)繼續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵一段時(shí)間，至生物量或產(chǎn)量達(dá)到最大后放罐，這樣，實(shí)現(xiàn)多批次的反復(fù)分批補(bǔ)料發(fā)酵就需要兩個(gè)以上的發(fā)酵罐[16,24]。在本實(shí)驗(yàn)中，選取進(jìn)入穩(wěn)定期的酵母進(jìn)行接種，此時(shí)的生物量和蝦青素產(chǎn)量已達(dá)到最大值，因此在每個(gè)批次發(fā)酵結(jié)束后，直接放罐，只留下部分發(fā)酵液作為下一個(gè)批次的種子在罐中，因此只需要1個(gè)發(fā)酵罐 (或搖瓶) 就可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)多個(gè)批次的反復(fù)分批發(fā)酵，而每個(gè)批次是一個(gè)完整的分批發(fā)酵流程。這種發(fā)酵方式節(jié)省了發(fā)酵設(shè)備，在工業(yè)發(fā)酵過(guò)程具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。

反復(fù)分批發(fā)酵過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)批次產(chǎn)量下降的情況[25-26]，其主要原因是菌種退化。在本實(shí)驗(yàn)中，與分批發(fā)酵 (第1個(gè)批次) 的結(jié)果相比，生物量和蝦青素產(chǎn)量并未出現(xiàn)下降，這說(shuō)明菌種穩(wěn)定性較好。反復(fù)分批發(fā)酵過(guò)程中出現(xiàn)產(chǎn)量下降的另一個(gè)可能原因是發(fā)酵液中乙醇、乙酸或其他代謝副產(chǎn)物的積累，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成受到抑制[27]。但在本實(shí)驗(yàn)的搖瓶反復(fù)分批發(fā)酵過(guò)程中，反而出現(xiàn)后 6個(gè)批次的蝦青素產(chǎn)量普遍高于第 1個(gè)批次的情況。比較搖瓶培養(yǎng)和5 L罐的發(fā)酵條件，可知搖瓶培養(yǎng)容易出現(xiàn)氧供應(yīng)不足的情況，因而發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生較多的乙醇、乙酸等酵解產(chǎn)物。文獻(xiàn)報(bào)道，在法夫酵母發(fā)酵過(guò)程中添加乙醇、乳酸、檸檬酸、乙酸等糖代謝產(chǎn)物，對(duì)法夫酵母產(chǎn)蝦青素有一定的促進(jìn)作用[8,14,21]。因此，在搖瓶培養(yǎng)中，部分葡萄糖代謝生產(chǎn)乙醇、乙酸等副產(chǎn)物，當(dāng)葡萄糖消耗完后，法夫酵母重新利用這些糖代謝產(chǎn)物，使蝦青素的合成受到促進(jìn)，蝦青素的產(chǎn)量提高。而在5 L罐發(fā)酵中，溶氧一直維持在40%左右，較少產(chǎn)生乙醇、乙酸等糖代謝副產(chǎn)物，而且發(fā)酵過(guò)程通過(guò)補(bǔ)料控制糖濃度在15~25 g/L 左右，糖代謝副產(chǎn)物的利用受到抑制，因此，第2個(gè)批次的蝦青素產(chǎn)量并未有明顯的提高。

4 結(jié)論

法夫酵母生產(chǎn)蝦青素?fù)u瓶反復(fù)分批發(fā)酵與 5 L罐反復(fù)分批補(bǔ)料發(fā)酵的研究結(jié)果表明：搖瓶發(fā)酵，4 d周期蝦青素產(chǎn)量和5 d周期的變化趨勢(shì)相似，4 d周期的蝦青素產(chǎn)量略高于 5 d的。以葡萄糖為碳源的5 L 罐發(fā)酵，相對(duì)第1批次，第2批次的生物量和蝦青素變化趨勢(shì)類似，最高生物量和蝦青素產(chǎn)量略有增加。以淀粉水解糖作為碳源的5 L罐發(fā)酵，以淀粉水解糖作為碳源，第1和第2批次的生物量、蝦青素含量、蝦青素單產(chǎn)、細(xì)胞得率、蝦青素得率變化趨勢(shì)相似，菌種沒(méi)有退化。

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Repeated batch and fed-batch process for astaxanthin production by Phaffia rhodozyma

Anfeng Xiao1,2, Hui Ni1,2, Lijun Li1,2, and Huinong Cai1,2
1 College of Bioengineering, Jimei University, Xiamen 361021, China
2 Research Center of Food Biotechnology, Xiamen 361021, China

Received: June 17, 2010; Accepted: August 11, 2010

Supported by: National Basic Research Programs of China (973 Program) (No. 2005CB523202), Key Projects in the National Science and Technology Pillar Program during the Eleventh Five-Year Plan Period (No. 2006BAD06A04).

Corresponding author: Xiaomei Wang. Tel: +86-451-85935004; E-mail: xmw@hvri.ac.cn

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2005CB523202),“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃 (No. 2006BAD06A04) 資助。