李愛(ài)峰，孫愛(ài)玲，柳仁民，呂 慧

(1.聊城大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東聊城252059;2.聊城高級(jí)財(cái)經(jīng)職業(yè)學(xué)校(第一校區(qū))，山東聊城252059)

高效液相色譜
——發(fā)光散射測(cè)定甜菊糖中甜菊糖苷和菜鮑迪苷A的含量

李愛(ài)峰1，孫愛(ài)玲1，柳仁民1，呂 慧2

(1.聊城大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東聊城252059;2.聊城高級(jí)財(cái)經(jīng)職業(yè)學(xué)校(第一校區(qū))，山東聊城252059)

建立了高效液相色譜－蒸發(fā)光散射分離與檢測(cè)甜菊糖中甜菊糖苷和萊鮑迪苷A的實(shí)驗(yàn)方法。色譜分離使用Kromasil NH2柱(250mm×4.6mm，i.d.，5μm)，流動(dòng)相為85%乙腈水溶液，柱流出物采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，漂移管溫度為85℃，空氣做載氣，流速為2.4L/min。甜菊糖苷和萊鮑迪苷A的線性范圍分別為0.05～3.0、0.05～3.7mg/mL，平均加標(biāo)回收率分別為97.63%、99.25%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.04%、1.27%。該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，適用于甜菊糖中甜菊糖苷和萊鮑迪苷A的定量分析。

甜菊糖，甜菊糖苷，萊鮑迪苷A，高效液相色譜，蒸發(fā)光散射檢測(cè)

甜菊糖是從菊科植物甜葉菊(Stevia rebaudiana Bertoni)的葉子中提取的一種天然甜味劑，具有高甜度、低熱量、安全無(wú)毒等特點(diǎn)，是一種可替代蔗糖的非常理想的甜味劑［1］。甜菊糖主要含有甜菊糖苷(stevioside，SS)、萊鮑迪苷A(rebaudioside A，RA)、萊鮑迪苷 C(rebaudiosideC，RC)、萊鮑迪苷 D(rebaudioside D，RD)、二糖苷(steriolbioside，SB)等八種成分［2］。在這八種成分中有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的為前四種，其中RA是甜味品質(zhì)最好的成分，含量?jī)H占25%左右，而含量占60%～70%的SS嚴(yán)重影響著甜菊糖的味質(zhì)［3］。因此，建立一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速的甜菊糖組分分離分析方法具有重要的意義。從二者的結(jié)構(gòu)式(如圖1所示)可以看出，由于RA和SS具有相同的母核結(jié)構(gòu)，差別僅在于葡萄糖基數(shù)目的不同，因此二者的極性相近，難以用常規(guī)手段分離。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的分離方法有毛細(xì)管電泳法［4］、高效液相色譜法［5］、薄層色譜法［6］等，其中高效液相色譜氨基柱法由于其方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確而被廣泛采用，由于RA和SS的紫外最大吸收波長(zhǎng)為195nm，使用紫外檢測(cè)器靈敏度很低。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(Evaporative Light Scattering Detector，ELSD)是一種新型的質(zhì)量型檢測(cè)器，特別適用于無(wú)生色團(tuán)、無(wú)紫外吸收或紫外末端吸收的組分的檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)使用氨基柱對(duì)RA和SS進(jìn)行了分離，使用ELSD進(jìn)行了檢測(cè)，運(yùn)用外標(biāo)法對(duì)于甜菊糖中二者的含量進(jìn)行了測(cè)定，該法簡(jiǎn)便、快速、重現(xiàn)性好，適用于甜菊糖中RA和SS的定量分析。

表1 RA和SS的回歸方程、線性范圍和檢出限

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甜菊糖樣品、SS、RA標(biāo)準(zhǔn)品 由某精細(xì)化工廠提供;甲醇 濟(jì)南試劑總廠;乙腈 色譜純，禹城化工廠;實(shí)驗(yàn)用水 為自制去離子水。

Unimicro HPLC泵及色譜工作站 通微(上海)分析技術(shù)有限公司;Attech ELSD2000ES蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 美國(guó)奧泰公司。

1.2 色譜分離與檢測(cè)條件

色譜柱:Kromasil NH2柱(250mm×4.6mm，i.d.，5μm，大連江申分離科學(xué)技術(shù)公司);流動(dòng)相:乙腈－水(85∶15，V/V);流速:1.0mL/min;進(jìn)樣量:20μL;柱溫:室溫;漂移管溫度:85℃;空氣流速:2.4L/min，分流閥狀態(tài):開(kāi)。

1.3 對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取SS和RA對(duì)照品各50mg，用甲醇溶解后定量轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，該溶液作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確移取上述溶液1、2、3、4、5mL分別置于10mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容，搖勻，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液備用，作為對(duì)照品溶液。

1.4 供試品溶液的制備

精確稱取甜菊糖樣品適量，置于50mL容量瓶中，加入適量流動(dòng)相振蕩至完全溶解，用流動(dòng)相定容，搖勻，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

為了選擇合適的色譜柱，實(shí)驗(yàn)考察了RA和SS在C18柱、C30柱和氨基柱上的分離情況，結(jié)果表明二者在C18柱和C30柱上幾乎沒(méi)有保留，在氨基柱上有較強(qiáng)的保留，可能是由于多個(gè)葡萄糖單元的存在使得分子具有強(qiáng)極性所致。使用氨基柱考察了流動(dòng)相的組成對(duì)于分離效果的影響，結(jié)果表明乙腈－水作為流動(dòng)相的分離效果明顯優(yōu)于甲醇－水。使用乙腈－水作為流動(dòng)相的分離效果如圖2所示，當(dāng)乙腈∶水=80∶20(V/V)時(shí)，SS與干擾組分分離效果不好;當(dāng)乙腈∶水=85∶15(V/V)時(shí)，SS與干擾組分達(dá)基線分離，時(shí)間也令人滿意;如果繼續(xù)增加乙腈的比例，保留時(shí)間太長(zhǎng)，峰展寬嚴(yán)重。

圖2 流動(dòng)相的組成對(duì)分離效果的影響

2.2 ELSD參數(shù)的選擇

漂移管的溫度和載氣的流速影響檢測(cè)器的響應(yīng)，漂移管的溫度升高，流動(dòng)相蒸發(fā)趨于完全，噪音減小，信噪比提高，但溫度過(guò)高則會(huì)使流動(dòng)相沸騰，噪音增大，甚至?xí)?dǎo)致組分部分汽化，響應(yīng)值變小;載氣的流速越小，流動(dòng)相蒸發(fā)后形成的溶質(zhì)顆粒越大，散射光的強(qiáng)度越大，響應(yīng)值越大，但流速太小會(huì)使流動(dòng)相蒸發(fā)不完全，噪音增大，信噪比降低。分別改變漂移管的溫度和載氣的流速，觀察噪音和響應(yīng)信號(hào)的大小，發(fā)現(xiàn)當(dāng)漂移管的溫度為85℃，載氣的流速為2.4L/min，分流閥開(kāi)時(shí)，信噪比最高。

2.3 線性關(guān)系考察

分別取不同濃度的對(duì)照品溶液20μL進(jìn)樣分析，由色譜工作站處理數(shù)據(jù)，以質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以峰面積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得SS與RA的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，并以信噪比等于3為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)得SS與RA的檢出限，見(jiàn)表1。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

配制RA和SS的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次20μL，分別測(cè)得峰面積，按照外標(biāo)法定量，計(jì)算各組分濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative Standard Deviation，RSD)分別為1.05%和0.97%，表明該法精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

配制RA和SS的混合對(duì)照品溶液，每隔4h進(jìn)樣分析一次，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20μL，分別測(cè)得峰面積，按照外標(biāo)法定量，計(jì)算各組分濃度的RSD分別為0.65%和0.37%，表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

在已知RA和SS含量的甜菊糖樣品中加入一定量的SS和RA標(biāo)準(zhǔn)品，混合均勻后進(jìn)樣分析，平行測(cè)定5次，按照外標(biāo)法定量并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。如表2所示，RA和SS的回收率均接近100%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

2.7 樣品測(cè)定結(jié)果

使用該方法對(duì)市售的甜菊糖樣品中RA和SS的含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 樣品加標(biāo)回收率

表3 樣品測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本文建立了HPLC－ELSD測(cè)定SS和RA的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，并進(jìn)行了方法學(xué)考察和實(shí)際樣品的測(cè)定，結(jié)果表明該法穩(wěn)定、準(zhǔn)確、快速，適用于甜菊糖中SS和RA的含量測(cè)定。

［1］婁力行.甜菊糖及其衍生物的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)糖料，2008(2):70－72.

［2］張亞雄，胡為民，胡濱.甜菊糖中A3甙分離方法初探［J］.中國(guó)食品添加劑，1998(4):48－49.

［3］朱海霞，鄭建仙.甜菊糖的酶法改性［J］.中國(guó)食品添加劑，2004(1):54－60.

［4］劉露露，顧正榮，饒琴.毛細(xì)管電泳檢測(cè)低熱量食品中甜菊糖甙的含量［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2009，30(4):113－116.

［5］趙永良，崔媛，劉景彬，等.高效液相色譜法測(cè)定甜菊糖甙中萊鮑迪甙A［J］.食品科技，2009，34(9):294－296.

［6］陳慕英，于喜水，孫玉華，等.甜菊甙類的研究［J］.中醫(yī)藥信息，2001，18(3):23－24.

Separation and identification of stevioside and rebaudiodside A in stevia by high performance liquid chromatography－evaparative light scattering detector

LI Ai－feng1，SUN Ai－ling1，LIU Ren－min1，LV Hui2
(1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Liaocheng University，Liaocheng 252059，China;2.Liaocheng Senior Financial Vocational School(No.1 Campus)，Liaocheng 252059，China)

A high performance liquid chromatography method for separation and determination of stevioside(SS)and rebaudiodside A(RA)in stevia was established.The analytical column was Kromasil NH2(250mm×4.6mm，i.d.，5μm).The mobile phase was acentonitrile－water(85∶15，V/V).The samples were determined by an evaparative light scattering detector.The drift tube temperature was kept at 85℃ and the flow rate of atmosphere was 2.4L/min.The calibration curves had good linearity in the range of 0.05～3mg/L for SS and 0.05～3.7mg/L for RA.The average recoveries of SS and RA were 97.63%(n=5，RSD=1.04%)and 99.25%(n=5，RSD=1.27%)，respectively.The method was a convenient，rapid and effective method for qualitatively analysis of SS and RA in stevia.

stevia;stevioside;rebaudiodside A;high performance liquid chromatography;evaparative light scattering detector

TS207.3

A

1002－0306(2011)04－0373－03

2010－04－28

李愛(ài)峰(1978－)，女，碩士研究生，講師，研究方向:分離科學(xué)。

聊城大學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(X081007)。